SG UNI EN ISO 9001: Certificato CSQ 9122 ASLB CALCOLO DELL INCERTEZZA DI MISURA

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1 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 1 di 31 INDICE 1. SCOPO pag.. CAMPO DI APPLICAZIONE pag. 3. DEFINIZIONI pag. 4. RESPONSABILITÀ pag MODALITÀ OPERATIVE pag Calcolo dell incertezza di misura nelle prove chimiche pag Metodo olistico pag Metodo metrologico pag Metodo metrologico semplificato pag Calcolo dell incertezza di misura nelle prove microbiologiche pag Regole per l espressione dell incertezza di misura pag Criteri per l espressione dell incertezza di misura pag ELENCO DOCUMENTI CORRELATI pag. 31 LISTA DI DISTRIBUZIONE Copia n 1: Responsabile Sezione Microbiologia (dott.ssa D. Mendogni).. Copia n : Responsabile Sezione Chimica (dott.ssa G. Molinari).. Copia n 3: ISS - ORL REDATTO EMESSO APPROVATO Funzione e Nome RQLSP Antonia Crippa RAQ del DPM Enrico Gotti RLSP Dott.ssa Daniela Mendogni N Rev. Data MOTIVO 0 30/04/007 Prima emissione 1 1/11/008 Revisione completa Firma

2 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina di SCOPO Scopo di questa procedura è quello di definire e documentare le modalità adottate dal LSP dell ASL della Provincia di Bergamo per il calcolo dell incertezza di misura.. CAMPO DI APPLICAZIONE La presente procedura viene applicata per calcolare l incertezza di misura da associare ai risultati di prove microbiologiche e chimiche eseguite sui campioni di acque e alimenti pervenuti al LSP. Non viene preso in considerazione l eventuale contributo all incertezza dovuto alla procedura di campionamento. 3. DEFINIZIONI Dove non altrimenti specificato le definizioni che seguono sono riprese dalla Norma UNI CEI ENV 13005:000 Guida all espressione dell incertezza di misura. Errori accidentali: sono dovuti a errori umani o a malfunzionamenti delle apparecchiature. Rendono non valide le operazioni di misura. Una volta riconosciuti, durante una o più misurazioni, devono essere eliminati dalle serie di misure, prima di procedere alle elaborazioni statistiche Errore assoluto (da esprimere con il termine scarto): differenza tra un singolo risultato ed il valore vero del misurando; fornisce un indicazione di quanto si discosta il risultato della misurazione dal valore vero) Errore casuale (da esprimere con il termine scarto aleatorio): componente dello scarto che nelle misurazioni ripetute varia in modo non prevedibile. Non può essere compensato, ma può essere ridotto aumentando il numero di osservazioni Errore sistematico (da esprimere con il termine scarto sistematico): componente dello scarto che, nelle misure ripetute, resta costante o varia in modo prevedibile. Non dipende dal numero di osservazioni, tuttavia può essere ridotto o tenuto sotto controllo i.d.m.: sigla utilizzata in questo documento per indicare l incertezza di misura Incertezza: parametro associato al risultato di una misurazione o prova, che caratterizza la dispersione dei valori ragionevolmente attribuibili al misurando. È, in sostanza, una stima della verosimiglianza della prossimità al miglior valore compatibilmente con il livello di conoscenza disponibile al momento Incertezza di misura: parametro, associato al risultato di una misurazione, che caratterizza la dispersione dei valori che possono essere ragionevolmente attribuiti al misurando Incertezza estesa: grandezza che definisce, intorno al risultato di una misurazione, un intervallo che ci si aspetta comprendere una frazione rilevante (solitamente il 95%) della distribuzione dei valori ragionevolmente attribuibili al misurando Incertezza tipo: incertezza del risultato di una misurazione espressa come scarto tipo Incertezza tipo composta: incertezza tipo del risultato di una misurazione allorquando il risultato è ottenuto mediante i valori di un certo numero di altre grandezze; essa è uguale alla radice quadrata

3 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 3 di 31 positiva di una somma di termini che sono le varianze o le covarianze di quelle grandezze, pesate secondo la variazione del risultato della misurazione al variare di esse Intervallo di confidenza (fiducia): intervallo di valori entro il quale, con un definito livello di fiducia, si trova il valore vero di un dato parametro di una popolazione (ISO 3534/1:006) Livello di fiducia: valore della probabilità associata a un intervallo di fiducia o ad un intervallo statistico di copertura Limite superiore/inferiore: valori estremi dell intervallo di fiducia Kp: Fattore di copertura. Fattore numerico utilizzato come moltiplicatore dell incertezza tipo composta per ottenere una incertezza estesa m.o.: sigla utilizzata in questo documento per indicare il termine microrganismo Scarto tipo (o Scarto tipo di ripetibilità): Radice quadrata positiva della varianza (Norma ISO 575-1:1994) Varianza: misura della dispersione delle osservazioni data dalla somma dei quadrati degli scarti aleatori rispetto alla media delle osservazioni divise per un numero pari a quelle delle osservazioni meno 1 (Norma ISO 575-1:1994) 4. RESPONSABILITÀ Le responsabilità relative al calcolo e all applicazione dell incertezza di misura sono affidate ai Responsabili di Sezione. L esecuzione delle prove necessarie per il calcolo dell incertezza è di competenza dei Tecnici di Sezione. 5. MODALITÀ OPERATIVE L esistenza di un incertezza associata ad un risultato analitico consente di aumentare la significatività e la validità di tutte le informazioni, indicando la qualità del risultato al quale essa è associata. Di seguito sono indicati i vari approcci per il calcolo dell incertezza di misura da associare a un risultato, al fine di poter esprimere sul Rapporto di Prova il risultato della prova e la sua i.d.m. 5.1 Calcolo dell incertezza di misura per le prove chimiche L incertezza di misura è il parametro che caratterizza la dispersione dei valori che potrebbero essere ragionevolmente attribuiti al misurando. L incertezza di misura è parte integrante del risultato di una misurazione e si esprime con la stessa unità di misura del risultato.

4 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 4 di 31 L incertezza di misura viene espressa come incertezza estesa U e ad un livello di probabilità del 95% nel seguente modo: U e = k U c dove U c è l incertezza composta assoluta e k è il fattore di copertura. Per un livello di probabilità p del 95% e con un numero di misurazioni indipendenti pari almeno a 10, il fattore k si può approssimare a ; in caso contrario k corrisponde alla t di Student al livello di probabilità del 95% con un numero di gradi di libertà pari a ν eff 1. Per il calcolo dell incertezza tipo composta possono verificarsi i seguenti casi: Metodi normalizzati che contengono dati di precisione (ripetibilità e/o riproducibilità) È necessario verificare che la precisione del laboratorio sia statisticamente compatibile con quella del metodo normalizzato secondo i criteri di seguito descritti. CRITERI DI ACCETTABILITÀ DELLA PRECISIONE Confronto con un metodo normalizzato che riporta dati di precisione La ripetibilità ottenuta dal laboratorio S r è accettabile quando è compatibile con i dati di precisione del metodo di riferimento (ripetibilità σ r e/o riproducibilità σ R ). I criteri di verifica della compatibilità sono i seguenti: a) Se il metodo di riferimento fornisce la ripetibilità σ r, si calcola il rapporto tra lo scarto tipo di ripetibilità ottenuto dal laboratorio S r ed il valore di riferimento σ r, verificando che il risultato sia compreso nell intervallo di fiducia i cui estremi sono i valori di A e B riportati nel Prospetto, Manuale UNICHIM 179/1, in funzione del numero di repliche eseguite e quindi dei gradi di libertà ν : S A r B σ Tabella ripresa da UNICHIM Manuale N.179/1 Prospetto ν = n 1 A B = n 1 r ν A B

5 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 5 di 31 b) Se il metodo di riferimento riporta solo la riproducibilità σ R e il laboratorio dispone della ripetibilità stretta S r, il criterio di verifica è il seguente: 1 σ R S r σ R 3 Se i criteri di compatibilità statistica non sono rispettati perché la precisione del laboratorio è migliore di quella di riferimento, occorre giustificare la migliore prestazione (ad esempio perché è stato utilizzato uno strumento di nuova generazione, quindi più preciso). Se i criteri di compatibilità non sono rispettati perché la precisione del laboratorio è peggiore, bisogna migliorare le prestazioni Confronto con un metodo normalizzato con dati di precisione assenti o incompleti a) Se esiste un altro metodo normalizzato, simile per matrice e tecnica di prova a quello di riferimento, che riporta dati di precisione, si verifica la compatibilità statistica tra lo scarto tipo fornito dal metodo normalizzato e quello ottenuto dal laboratorio secondo i criteri esposti al punto b) Se il metodo di riferimento non riporta dati di precisione, si può calcolare lo scarto tipo di riproducibilità applicando l equazione di Horwitz al livello di concentrazione C per cui si intende validare il metodo: σ H = 0,0 C 0,8495 dove σ H e C sono espressi in frazione di massa (ad esempio: 1mg Kg 1ppm 10 Kg Kg ). L equazione è applicabile nell intervallo di concentrazione compreso tra 0.1 g/kg e 100 g/kg). Pertanto, se il laboratorio dispone dello scarto tipo di ripetibilità S r, si verifica che il rapporto tra S σ sia compreso nell intervallo: r H 1 Sr σ Se il criterio di compatibilità statistica è rispettato, allora la precisione ottenuta dal laboratorio è accettabile. H In generale, nel caso di determinazioni di componenti in tracce dispersi in matrici complesse, occorre considerare che la relazione tra precisione accettabile, espressa come CV R (%), e livello di concentrazione C, è data dalla relazione di Horwitz (ricavata da prove interlaboratorio): CV R(%) = 3 ( 1 0,5 log C ) 6

6 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 6 di 31 dove CV R (%) è il coefficiente di variazione percentuale della riproducibilità e C la concentrazione espressa come frazione di massa. Utili criteri di accettabilità della precisione possono essere desunti da Direttive della Comunità Europea; di seguito si riporta una tabella che indica i valori massimi accettabili di CV R %, in funzione del livello C di analita ricercato a cui il laboratorio può riferirsi : C = Concentrazione di analita nella matrice (µg/kg) Grado di imprecisione interlaboratorio C 1 CV% = 64 1 < C 10 CV% = < C 100 CV% = < C 1000 CV% = 3 C > 1000 CV% = 16 Se i criteri sono soddisfatti, cioè se la precisione è accettabile, allora lo scarto tipo di riproducibilità del metodo normalizzato σ R fornisce una stima dell incertezza tipo composta del laboratorio, mentre l incertezza estesa, con livello di con probabilità del 95%, è pari a: dove è il fattore di copertura. U e = Pertanto se u.m. è l unità di misura del dato ( y ), il risultato finale può essere espresso come segue: σ ( y σ ) R ± R u.m Metodi normalizzati con dati di precisione assenti o incompleti - Metodi interni a) Riferibilità ad un metodo normalizzato simile Se esiste un metodo normalizzato, simile per campo di applicazione (matrice) e tecnica di prova a quello preso a riferimento, che riporta dati di precisione, si utilizzano questi ultimi secondo quanto riportato al punto b) In tutti gli altri casi (METODO DI HORWITZ) Questo criterio, basato sul presupposto che gli errori casuali sono inversamente proporzionali alla concentrazione e vista la prevalenza di errori casuali nelle prove chimiche, è definito da un espressione matematica empirica che lega la concentrazione dell analita al coefficiente di

7 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 7 di 31 variazione percentuale. L espressione matematica è tratta dall osservazione di un elevato numero di misure, effettuate a concentrazioni note, ricavate dai vari esercizi di interconfronto (collaborative trials). Anche in questo caso questo approccio si avvicina al modello basato sull assoluta indipendenza delle misure ottenute, facendo variare in modo consistente il fattore tempo. Questa relazione, di carattere empirico e con campo di applicazione senza limitazioni di matrice e campo di misura, deve essere utilizzata con precauzione per la valutazione dell incertezza di misura, anche se non può essere trascurata, in quanto relazione utilizzata in alcuni casi dal legislatore nel campo dell analisi degli alimenti. Tale criterio è infatti utile, in fase di primo approccio, nella valutazione dell incertezza. Nel caso in cui non si conoscano dati di ripetibilità del metodo in questione, può essere utilizzato dall operatore nelle fasi di applicazione di un metodo normalizzato e nella verifica delle sue performances, o nelle fasi di progettazione di un metodo interno. Il laboratorio può, infatti, prendere come riferimento la riproducibilità target fornita dalla relazione di Horwitz, e riportarsi in termini di ripetibilità, utilizzando il rapporto suggerito dagli autori (recepito in alcuni casi anche dal legislatore). Se il metodo di riferimento è applicato a matrici agro-alimentari o acqua si può assumere come scarto tipo di riproducibilità del metodo normalizzato, espresso come scarto tipo relativo CV%, quello ottenuto applicando l equazione di Horwitz in funzione del livello di concentrazione del misurando, come da tabella seguente: Tabella D Concentrazione CV% H Horwitz Concentrazione CV% H Horwitz 0,1 µg/kg mg/kg 11 1 µg/kg mg/kg 8 10 µg/kg 3 1 g/kg µg/kg 3 10 g/kg 4 1 mg/kg g/kg 3 Il metodo di Horwitz si basa sul presupposto che gli errori casuali sono inversamente proporzionali alla concentrazione, e vista la prevalenza di errori casuali nelle prove chimiche, è definito da un espressione matematica empirica che lega la concentrazione del misurando al coefficiente di variazione percentuale. L espressione matematica, tratta dall osservazione di un elevato numero di misure effettuate a concentrazioni note, ricavate dai vari esercizi di interconfronto (Collaborative trials), è la seguente: CV H(%) = ( 1 0,5 log C )

8 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 8 di 31 dove CV H (%) è il coefficiente di variazione percentuale della riproducibilità e C la concentrazione espressa come frazione di massa, cioè con la stessa unità di misura al numeratore e al denominatore, esempio: 1 ppm = 1 mg/kg = 0, ppb = 1 µg/kg = 0, Per applicare la relazione di Horwitz è necessario verificare che la ripetibilità del laboratorio S r sia compatibile con la riproducibilità σ H calcolato con Horwitz, secondo i criteri precedentemente esposti: 1 σ H Sr σ 3 H dove: σ H = 0,0 C 0,8495 L equazione sopra scritta è valida nell intervallo di concentrazione: 100 µg/kg < C < 100 g/kg Se i criteri sono soddisfatti, allora lo scarto tipo di riproducibilità calcolato secondo Horwitz fornisce una stima dell incertezza composta del laboratorio, mentre l incertezza estesa è pari a: U e = σ dove è il fattore di copertura con probabilità del 95%. Pertanto se u.m. è l unità di misura del dato ( y ), il risultato finale può essere espresso come segue: ( y σ ) H ± H u.m. Sono stati documentati scostamenti (Thompson) dall equazione di Horwitz: - per concentrazioni inferiori a 10 µg/kg l equazione di Horwitz fornirebbe valori eccessivamente elevati, per cui l incertezza si calcola secondo la correzione di Thompson, cioè: dove C è la concentrazione effettiva. σ H = 0, C

9 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 9 di 31 - Per concentrazioni superiori a 138 g/kg l equazione di Horwitz per il calcolo dello scarto tipo di riproducibilità diventa: σ H = 0,01 C 0,5 L approccio descritto va comunque considerato con cautela ed è opportuno che venga confermato con prove su materiali di riferimento (possibilmente certificati) o attraverso la partecipazione a circuiti interlaboratoriali. 5. METODO OLISTICO Il metodo olistico è applicabile qualora esistano test interlaboratoriali (Collaborative Trial o Proficiency Test) relativi al metodo che si intende validare, i cui risultati siano elaborati statisticamente. La variabilità dei risultati così ottenuti può essere considerata casuale e le prove eseguite indipendenti. Si può così ritenere che l incertezza tipo composta coincida con la precisione dell insieme dei risultati forniti dai diversi laboratori e quindi con la riproducibilità del metodo di prova. Nel caso di Collaborative Trial, in cui tutti i laboratori partecipanti eseguono lo stesso metodo, sulla stessa matrice e per lo stesso parametro di cui si intende stimare l incertezza, lo scarto tipo di riproducibilità del circuito S R coincide con l incertezza tipo composta del metodo. Pertanto, se il laboratorio ha ottenuto risultati accettabili (verifica dello z-score) e la ripetibilità del metodo è adeguata allo scopo, l incertezza di misura può essere espressa in funzione dello scarto tipo di riproducibilità del circuito, secondo la seguente espressione: ( y ± S R ) u.m. Se il laboratorio dispone dei risultati di un Collaborative Trial, pur non avendo partecipato al circuito di interconfronto, può comunque utilizzare lo scarto tipo di riproducibilità dopo aver verificato la compatibilità statistica del proprio scarto tipo di ripetibilità S r con quello di riproducibilità fornito dal circuito, secondo i criteri descritti al punto Nel caso di Proficiency Test è invece necessario estrapolare i dati ottenuti con il metodo per il quale si vuole stimare l incertezza e calcolare lo scarto tipo di riproducibilità. 5.3 METODO METROLOGICO Se non è possibile ricondursi ai casi sopra citati, il laboratorio deve valutare tutte le fonti di incertezza che sono significative ai fini del calcolo dell incertezza tipo composta che, moltiplicata

10 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 10 di 31 per il fattore di copertura al livello di probabilità del 95%, fornisce la stima dell incertezza estesa del metodo. Il calcolo dell incertezza di misura con il metodo metrologico prevede la suddivisione del processo nella sequenza completa delle operazioni che lo compongono e l attribuzione ad ognuna della variabilità associata. Il processo può essere ripartito in diverse fasi riassumibili così come segue: - definizione dei misurandi; - identificazione delle sorgenti di incertezza e distinzione tra contributi di tipo A e di tipo B (i contributi di tipo A sono valutabili da considerazioni statistiche di misure ripetute, mentre i contributi di tipo B sono stimati in termini di scarto tipo, valutato da distribuzione di probabilità ipotizzate sulla base dell esperienza, o da informazioni di altro genere); - quantificazione dei singoli contributi all incertezza; - calcolo dell incertezza composta ed estesa del metodo di prova. Occorre definire quali sono le variabili che hanno influenza sul risultato finale (grandezze di ingresso) e in che relazione sono tra loro; in generale sarà possibile individuare una relazione funzionale che lega il risultato di una misurazione ed i parametri d ingresso: Risultato = f(x, Y, Z, ecc..) dove: X, Y, Z, ecc.. sono i parametri di ingresso della relazione funzionale Indicando con u(x), u(y), u(z), ecc.. le incertezze tipo associate alle grandezze d ingresso, l incertezza tipo composta U c associata al risultato sarà data dalla seguente relazione: U c = + f u X f Y f Z ( X ) + u( Y ) + u( Z )... Le sorgenti di incertezza di un metodo di prova sono generalmente riconducibili a: - singoli passaggi e fasi analitiche che rientrano nel procedimento e la cui variabilità influisce sulla dispersione dei risultati; - operatori diversi che eseguono lo stesso metodo di prova; - tarature di apparecchiature analitiche complesse (gascromatografi, spettrofotometri, ecc..); - tarature di apparecchiature analitiche semplici (bilance, stufe, ecc..); - uso di attrezzature da laboratorio tarate (vetreria, pipette,...); - incertezze dei materiali e dei campioni di riferimento. È necessario distinguere tra le diverse sorgenti di incertezza i contributi di tipo A e di tipo B. Nella precisione del metodo sono comprese tutte le incertezze di tipo A ascrivibili ai singoli passaggi del procedimento analitico, inclusa la variabilità dell operatore qualora le prove siano state eseguite da operatori diversi. I contributi di tipo A derivano da fattori che non possono essere tenuti sotto controllo o il cui effetto quantitativo non può essere ragionevolmente determinato a priori,

11 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 11 di 31 sono di origine sia tecnico-strumentale, sia umana, sia ambientale; vengono valutate a posteriori sulla base di ripetizioni di prove; viene espressa in termini di ripetibilità del metodo come scarto tipo. I contributi di tipo B portano a variazioni costanti e ripetibili e derivano da fattori prevalentemente di origine tecnico-strumentale, ma possono comprendere anche gli effetti dei fattori umani e ambientali, se precedentemente analizzati e quantificati. Sono incertezze di tipo B: l incertezza dei materiali di riferimento, l incertezza dell attrezzatura tarata, l incertezza dovuta alle tarature strumentali, l incertezza dovuta alle condizioni ambientali, l incertezza dovuta al recupero, ecc.; sono stimati in termini di scarto tipo, sulla base di specifiche fornite dal produttore, dati di letteratura, esperienze precedenti, ecc. Identificate le varie sorgenti di incertezza è necessario valutarle numericamente calcolando il valore relativo (adimensionale) di ciascun termine rispetto al misurando specifico, ottenendo quindi una incertezza tipo relativa. La relazione generale che esprime l incertezza composta relativa ( ) c U& ( u& ( X )) + ( u& ( Y )) + ( u( Z ))... = & c + dove u& ( X ), u& ( Y ), u& ( Z ),ecc.. sono incertezze relative. La relazione precedente può essere scritta nel modo seguente: U& U & è la seguente: ( u& ) + ( u& ) + ( u& ) + ( u& ) + ( u& ) + ( u )... = & c ripetibilità pesata tarature diluizione riferimento recupero + dove sono separati i contributi di incertezza di tipo A da quelli di tipo B non inclusi nella ripetibilità. L incertezza tipo composta assoluta U c si ottiene moltiplicando l incertezza composta relativa per il risultato delle misure y : Uc = U & c y U & c L incertezza estesa U e ad un livello di probabilità del 95% è espressa nel seguente modo: U = k e U c dove U c è l incertezza composta assoluta e k è il fattore di copertura Incertezza di ripetibilità

12 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 1 di 31 L incertezza di ripetibilità ( ripetibilità ) u si calcola dallo scarto tipo S r ottenuto in fase di validazione attraverso l esecuzione ripetuta n volte dell intero procedimento analitico in tutte le diverse fasi: preparazione del campione (macinazione, disgregazione, digestione, ecc ), estrazioni, trattamenti di purificazione, diluizione, concentrazione, analisi strumentale, ecc. Incertezza di ripetibilità u ripetibili tà = Sr n Il valore relativo dell incertezza di ripetibilità si calcola nel seguente modo: Incertezza relativa di ripetibilità u& S r n x ripetibili tà = = u ripetibilità x dove X è il risultato medio delle n prove indipendenti per il quale si vuole calcolare il contributo di ripetibilità Incertezza della pesata Dalla scheda di taratura della bilancia è possibile ricavare l incertezza estesa di taratura e calcolare l incertezza composta assoluta u dividendo per il fattore di copertura k indicato nel certificato (di solito k è pari a ): Tbilancia u T = bilancia u e bilancia L incertezza relativa si calcola dividendo l incertezza composta assoluta della bilancia per la pesata del campione: u& pesata = u T k bilancia Nel caso in cui il peso che compare nella relazione funzionale per il calcolo del risultato sia una differenza tra pesate (peso lordo e tara), è necessario tenere conto della doppia pesate; in tal caso l incertezza della pesata sarà espressa da: P

13 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 13 di 31 u& pesata = ( u ) + ( u ) Tara P Campione Nel caso in cui la tara sia circa dello stesso ordine di grandezza del campione la relazione diventa: u& pesata = u pesata P Incertezza di diluizione e prelievo di liquidi Le diluizioni ed i prelievi di soluzioni liquide vengono eseguiti per pesata o volumetricamente mediante l utilizzo di vetreria tarata. Nel primo caso valgono le considerazioni fatte al punto precedente: in questo caso infatti l incertezza di prelievo o diluizione è riconducibile all incertezza di pesata. Nel secondo caso bisogna considerare le seguenti fonti di incertezza: - l incertezza connessa con l operazione di portare a volume noto o di misurare un determinato volume è da considerare parte della ripetibilità qualora l operazione venga ripetuta più volte per ciascuna delle n prove eseguite. Nel caso in cui l operazione di prelievo o diluizione sia stata eseguita 1 sola volta nell arco delle n prove di ripetibilità allora tale termine sarà da valutare separatamente e sommare a quello relativo alla taratura della vetreria. - l incertezza derivante dalla taratura della vetreria T vetreria, che non è compresa nella ripetibilità. Quest ultimo contributo è dovuto alla tolleranza dichiarata dal costruttore per la quale si assume una distribuzione rettangolare di probabilità, da cui deriva che l incertezza di taratura è: u ut vetreria = a 3 dove a è la tolleranza della vetreria, come da specifica del fornitore. L incertezza relativa di taratura della vetreria è:

14 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 14 di 31 u& T = vetreria u T vetreria V dove V è il volume misurato. Nel caso in cui si utilizzino attrezzature volumetriche (micropipette) per le quali è nota l incertezza estesa è possibile calcolare l incertezza composta assoluta copertura k posto uguale a. u micropipetta dividendo per il fattore di L incertezza relativa si calcola dividendo l incertezza composta assoluta per il volume misurato: u& micropipet = Incertezza della retta di taratura strumentale ta u micropipetta L incertezza di taratura strumentale si calcola a partire dall equazione che lega la risposta strumentale y i (per ogni soluzione di riferimento si eseguono, se possibile, più letture e si effettua l interpolazione con il valore medio) con le concentrazioni C i. V Equazione della retta interpolante : y = a + b C i i Sulla base dei parametri caratteristici della retta, è possibile calcolare lo scarto tipo dei residui secondo l equazione: ( yi ŷi ) S y / x = n L incertezza tipo di taratura u taratura da associare al valore C i, ottenuto effettuando una misurazione y i, è data dalla seguente relazione: u taratura = S y / x b 1 m n b ( y y) i i ( C C )

15 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 15 di 31 dove b è la pendenza della retta, n è il numero di punti (livelli) utilizzati nella costruzione della retta interpolante, m è il numero di ripetizioni della misura strumentale il cui risultato medio è y i, yi a Ci è il valore di concentrazione corrispondente così determinato: Ci = b mentre C e y sono i valori medi delle variabili C e y con le quali si è costruita la retta di taratura. Il valore dell incertezza relativa di taratura strumentale, in corrispondenza del valore C i, è: u & = taratura u taratura C i Incertezza del recupero Se il valore del recupero viene utilizzato per correggere il risultato finale, occorre tener conto del suo contributo all incertezza del metodo. L incertezza relativa del recupero medio u& Re c è data da: S u& + n Re c Re c = u& CRM dove e u& S Re c è lo scarto tipo del recupero medio, n il numero di prove utilizzate per la ripetibilità CRM è l incertezza tipo composta del materiale di riferimento. S Re c = S Re c n Incertezza dei materiale di riferimento Per valutare questo termine si deve prendere in considerazione il grado di purezza certificato dalla ditta fornitrice e la vetreria e le attrezzature volumetriche utilizzate eventualmente nella preparazione di soluzioni del materiale di riferimento. L incertezza tipo del materiale di riferimento certificato secondo la seguente relazione: a u CRM = 3 u CRM si ricava dal certificato di analisi

16 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 16 di 31 dove a è l errore massimo garantito dal costruttore (es: se il certificato riporta 1000 ±, lo scarto tipo è 3 ). 5.4 METODO METROLOGICO SEMPLIFICATO Nei casi molto frequenti in cui le componenti significative dell incertezza sono quelle dovute alla ripetibilità (su almeno 10 replicati indipendenti) e alla retta di taratura (su almeno 4 livelli di concentrazione), si può seguire l approccio semplificato che consiste nel combinare tra loro le incertezze estese relative di ripetibilità e di taratura strumentale secondo la relazione: ( U( & y ) ) ( U( & y ) U & + e ( y ) = ripetibilità ) tarature L incertezza estesa assoluta è data da: Ue = U & e( y ) y Tale approccio semplificato è in ogni caso cautelativo perché porta a formulare una incertezza estesa superiore o uguale a quella che si otterrebbe calcolando i gradi di libertà effettivi. Il risultato finale della misura si esprime come segue: ( y U ( y )) ± e u.m.

17 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 17 di NELLE PROVE MICROBIOLOGICHE Considerazioni generali In ambito microbiologico l obiettivo della misurazione è la determinazione del numero N di microrganismi presenti in un campione (conta delle colonie). L i.d.m. può essere calcolata mediante diversi approcci: Metrologico Metrologico semplificato Poisson Olistico (scarto tipo di riproducibilità) Approccio metrologico (o approccio bottom-up) In microbiologia questo approccio, basato sul calcolo del contributo delle varie incertezze (ripetibilità di dosaggio delle pipette, ripetibilità dosaggio diluente, ripetibilità conteggio operatori, ecc.), è molto impegnativo. Infatti, non è facile costruire un modello onnicomprensivo del processo di misurazione per le seguenti ragioni: 1. instabilità dei campioni, siano essi costituiti da matrici alimentari o ambientali (i microrganismi possono essere presenti nei campioni in una grande varietà di stati fisiologici);. presenza nelle matrici sottoposte a prova di diversi stipiti, specie o generi di m.o.; 3. variabilità esistente tra i sottocampioni, più elevata di quella derivante dall esecuzione ripetuta della prova; 4. distribuzione dei microrganismi nel campione. È possibile pertanto incorrere sia in errori di sovrastima che di sottostima dell i.d.m. per la difficoltà a quantificare il contributo di ogni singolo fattore al processo analitico. Metrologico semplificato - Il metodo metrologico semplificato, basato sul calcolo del parametro G, non richiede il calcolo delle singole componenti d incertezza ma tiene conto delle componenti date da: distribuzione di Poisson, incertezza dei volumi di inoculo e incertezza di lettura delle piastre. Il G esprime il grado di proporzionalità dei conteggi in un sistema rivelatore multiplo. dove: z i = conta delle colonie nella i-esima piastra di Petri v i = volume di sospensione distribuita nella i-esima piastra (in ml) n = numero di piastre Z = somma di tutte le conte i-esime V = somma dei volumi delle i-esime sospensioni Come valore guida cui fare riferimento per esprimere un giudizio di proporzionalità il G deve essere confrontato con i valori delle tavole del Chi quadro (χ) per n-1 gradi di libertà.

18 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 18 di 31 Il valore assunto dal G permette di valutare se l operatore ha lavorato in maniera accettabile e se i conteggi ottenuti alle distinte diluizioni possono considerarsi congruenti tra loro. Il risultato che si ottiene è di solito sovrapponibile a quello ottenuto con l indice di dispersione di Poisson. Tale condizione è valida se: G χ p=0,95 (n-1) L incertezza relativa composta, per il cui calcolo si fa ricorso al valore di G, si ricava dall equazione dove: Z n G = somma di tutte le conte = numero totale delle piastre sottoposte a conta = stima del logaritmo del rapporto di verosimiglianza della linearità delle conte (proporzionalità dei conteggi) Il rapporto G / n-1, noto anche come rapporto di Lexis, dà informazioni sul grado di variabilità delle conte sottoposte a valutazione, secondo le categorie riportate nella tabella seguente: G / n-1 = 1,0 G / n-1 > 1,0 valore atteso nella classica distribuzione di Poisson variabilità non imputabile alla sola distribuzione di Poisson G / n-1 > 5,0 presenza di problemi analitici Il metodo semplificato permette di valutare l incertezza relativa che include tutte le componenti casuali che influenzano le conte in un sistema multiplo. È un metodo efficace perché esprime i valori di incertezza in funzione della qualità della prestazione analitica che ha prodotto il risultato. Poisson - La norma UNI CEI ENV (Guida all espressione dell incertezza di misura) è priva di esempi specifici dedicati all ambito microbiologico, pur presentando principi applicabili anche a questo campo. Quando nelle prove microbiologiche si hanno sospensioni ben miscelate, in cui le cellule microbiche sono perfettamente distribuite, i misurandi (germi) seguono la distribuzione di Poisson; è pertanto possibile calcolare l incertezza di misura applicando tale modello secondo il quale la media è numericamente uguale alla varianza: µ = σ

19 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 19 di 31 Secondo l approccio di Poisson, eseguire misure sulla dispersione dei risultati per determinare scarti tipo di ripetibilità non ha utilità pratica poiché le informazioni sulla dispersione dei dati si possono ottenere dalla media dei risultati (o dal risultato stesso). Il modello di Poisson ha l indubbio vantaggio che una singola valutazione può essere collegata ad ogni determinazione. Per esprimere l incertezza di misura si utilizza un intervallo di confidenza al 95% di probabilità. Olistico (o approccio top-down) - Nel caso si conoscano dati di riproducibilità e siano garantiti i requisiti di applicabilità è possibile utilizzare l approccio olistico (possibilità di associare l incertezza al metodo e non alla singola prova) basato sulla ripetizione della prova in condizioni di riproducibilità intra- o inter- laboratorio, tali da prendere in considerazione tutti i fattori sistematici che possono variare durante l esecuzione della prova. Questo tipo di approccio utilizza i risultati di una stessa misura, eseguita in laboratori diversi. La variabilità dei risultati così ottenuti può essere considerata casuale e le prove ottenute possono essere considerate tra loro indipendenti. Questa condizione è quella che più si avvicina alle condizioni di massima indipendenza delle misure ripetute. Ne consegue che lo strumento per ottenere questa condizione è la partecipazione del laboratorio a Collaborative trial, dove tutti i laboratori partecipanti utilizzano lo stesso metodo di prova, per uno stesso parametro, sulla stessa matrice. Considerando che, in condizioni di massima indipendenza, l incertezza coincide con la precisione ottenuta dai diversi laboratori, la grandezza significativa da utilizzarsi come parametro fondamentale per la valutazione dell incertezza è la riproducibilità del metodo. Il maggior vantaggio dell approccio top-down è quello che casualizza gli errori sistematici dei laboratori, tenuto conto della caratteristica delle misure microbiologiche dove, prevalentemente, si verificano errori di tipo casuale. Conoscendo la riproducibilità del metodo, parametro completo nella valutazione della precisione, perché tiene conto di tutte le possibili variabilità all interno e all esterno dei laboratori, si attribuisce ad esso il valore dell incertezza composta e, successivamente, tramite opportuno fattore di copertura, l incertezza estesa. Applicando questa metodologia al caso reale, nell affrontare il problema dell incertezza di misura per una prova normalizzata o non normalizzata, ci si dovrà preliminarmente interrogare sull esistenza di una validazione adeguata allo scopo e, se esistente, ci si dovrà accertare della conoscenza della riproducibilità del metodo. In caso affermativo, dallo scarto tipo di riproducibilità (che corrisponde all incertezza composta), tramite opportuno fattore di copertura, si ottiene l incertezza estesa del metodo. Tutto questo, naturalmente, previa verifica che le performances operative del laboratorio (precisione e campo di applicazione) siano congrue a quelle descritte dalla validazione del metodo. Per far ciò, è necessario valutare il rapporto tra lo scarto tipo di ripetibilità ristretta del laboratorio e lo scarto tipo di ripetibilità riportata dal metodo normalizzato (quando conosciuto), o lo scarto tipo accettato dal laboratorio, e verificare che il suo valore rientri nell intervallo definito dagli estremi riscontrabili nelle tabelle statistiche. La verifica deve essere descritta e formalizzata indicando la metodologia e i criteri scelti per la stessa. In alternativa è possibile partecipare ad un Collaborative trial in cui tutti i laboratori partecipanti impiegano lo stesso metodo, sulla stessa matrice, per lo stesso parametro per il quale si intende

20 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 0 di 31 calcolare l incertezza. Dal risultato delle elaborazioni statistiche, scartati i dati aberranti (outliers), si ottiene lo scarto tipo di riproducibilità a cui corrisponde l incertezza composta. Una terza possibilità può essere quella di partecipare a Proficiency test, utilizzando la metodica di interesse dove i laboratori partecipanti impiegano il metodo normalmente in uso. Dai risultati dell esercizio, dopo opportuna estrapolazione dei dati ottenuti con il metodo per il quale si vuole valutare l incertezza, si calcola lo scarto tipo di riproducibilità e, da questo, mediante fattore di copertura, si valuta l incertezza estesa. In questo caso è opportuno calcolare il numero di gradi di libertà effettivi, significativi per la riproducibilità. Con questo valore, si ricava il t di Student dalle tabelle statistiche e gli si attribuisce il fattore di copertura. Esiste anche una quarta possibilità: avendo a disposizione i risultati di un Collaborative trial, pur non avendo partecipato all esercizio, il laboratorio può utilizzare lo scarto tipo di riproducibilità (se fornito dall organizzatore del circuito interlaboratorio), previa verifica della sua ripetibilità con quella riportata dal Collaborative trial. Per riportare l incertezza composta da una significatività del 68% (perché espressa in termini di scarto tipo di riproducibilità) ad una significatività normalmente accettata del 95%, si moltiplica l incertezza composta per il fattore di copertura (K p = ). Una considerazione particolare deve essere fatta, riguardo la scelta di questo fattore. Quando i test sono sufficientemente significativi dal punto di vista statistico il fattore di copertura può essere assunto uguale a due, che corrisponde al valore approssimato del t di Student. Visti i diversi approcci per il calcolo dell incertezza di misura, spetta al laboratorio la scelta del criterio da utilizzarsi, tenendo presente le indicazioni della norma UNI CEI EN ISO/IEC 1705:005, che indica che la procedura di valutazione dell incertezza scelta dal laboratorio non deve determinare un intervallo non realistico per il metodo considerato ACQUA L incertezza legata ai risultati viene calcolata come intervallo di fiducia al 95% di probabilità, dopo aver verificato in fase di convalida del metodo ufficiale o normalizzato o in fase di validazione del metodo che il laboratorio produca dati corretti secondo la distribuzione di Poisson (vedi IOLSP14B Validazione di un metodo microbiologico). La verifica della ripetibilità va eseguita nel tempo secondo la Istruzione Operativa sul controllo dei risultati nelle prove microbiologiche (IOLSP16). Le modalità di conteggio sono specificate nella IOLSP18 Criteri di valutazione di accettabilità dei conteggi e attribuzione dei risultati nelle prove microbiologiche e, per comodità, riportate nei singoli metodi. Per la matrice acqua la norma di riferimento è la ISO 8199:005 che richiama le norme EN ISO 718:1996 e ISO/TR 13843:000 (= ENV ISO 13843:001). La norma UNI ENV ISO 13843:003 è la versione ufficiale in lingua italiana della norma europea sperimentale ENV ISO (edizione maggio 001) e tiene conto delle correzioni introdotte il 15 agosto 001. Secondo la ISO 8199:005 i criteri per la scelta delle piastre sulle quali eseguire i conteggi, salvo diverse disposizioni dei metodi, sono definiti dalla Tabella A.

21 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 1 di 31 Tabella A Metodo N colonie Senza interpretazione delle colonie Spatolamento Membrane filtranti Inclusione Con interpretazione delle colonie Spatolamento Membrane filtranti Inclusione Conteggio di UFC sino a 15 colonie Se si riscontra un numero UFC per ogni prova inferiore o uguale a 15 per il calcolo dell intervallo di fiducia è opportuno riferirsi: alla Tabella 1 se il metodo non prevede che la prova venga condotta in doppio alla Tabella se il metodo prevede una prova in doppio. TABELLA 1 (tab. A.1 allegato A Norma 718:1996; prospetto 1 Norma UNI 10674:00) Limiti dell intervallo di fiducia, a livello di probabilità del 95%, del conteggio effettuato su una piastra Petri NUMERO DI LIMITE DI CONFIDENZA SCARTO PERCENTUALE () MICRORGANISMI (1) inferiore superiore inferiore superiore 1 < < < (1) Equivalente al numero di colonie presenti sulla capsula () Riferito al conteggio dei microrganismi della 1 a colonna

22 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina di 31 TABELLA (tab. A. allegato A Norma 718:1996; prospetto Norma UNI 10674:00) Limiti dell intervallo di fiducia, a livello di probabilità del 95%, del conteggio effettuato su due piastre Petri LIMITE DI NUMERO DI NUMERO DI SCARTO PERCENTUALE () CONFIDENZA COLONIE (1) MICRORGANISMI inferiore superiore inferiore superiore 1 1 < < < (1) Conta totale su due piastre Petri sullo stesso campione () Riferito al numero dei microrganismi della a colonna

23 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 3 di 31 ESEMPIO DI INTERPRETAZIONE: Conteggio di UFC maggiore di 15 e sino a circa 300 Estremamente semplificato è il metodo di calcolo proposto dall American Standard Methods riportato nella UNI ENV ISO 13843:003 e ripreso dalla UNI 10674:00, che si basa sull equivalenza tra il conteggio e la varianza. Per conteggi in singola piastra superiori a 15 UFC/unità di campione permette di calcolare i limiti di fiducia al 95 % di probabilità Prove singole Dopo aver verificato che il metodo sia sotto controllo e nel caso non si utilizzino risultati provenienti da diluizioni diverse, l espressione per esprimere il risultato con l intervallo di fiducia è la seguente: C = C ± Kp i C i dove: C i = risultato del conteggio delle colonie presenti nella capsula Petri Kp = fattore di copertura al 95% di probabilità (può essere approssimato a ) Esempio 1: Conteggio piastra: C i = 70 C = 70 ± 70 C = 70 ± x 7 Il risultato finale sarà quindi: C = 70 ± 54 (intervallo di fiducia: da 666 a 774)

24 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 4 di Prove replicate (prove in doppio) Nel caso di prove replicate, dopo aver verificato che il metodo sia sotto controllo e nel caso non si utilizzino risultati provenienti da diluizioni diverse, è necessario valutare il limite di ripetibilità attraverso il calcolo del fattore di copertura sperimentale, K p, mediante la seguente equazione: dove C 1 e C sono i valori dei due conteggi riscontrati sulle prove condotte in parallelo. K p = 1,96,0,0 > K p =,576,6 K p >,6 La dispersione dei conteggi è accettabile La dispersione dei conteggi è considerata critica, è necessario approfondire prima di esprimere il risultato. Verificare eventualmente il conteggio della diluizione successiva La dispersione dei risultati è inaccettabile Qualora K p,0 si esprime il risultato come media dei due conteggi calcolando il relativo intervallo di confidenza con la seguente formula: Dove: C C i n C = Ci ±1.96 = conteggio finale = risultato medio del conteggio delle colonie presenti sulle capsule Petri = numero di repliche utilizzate per il calcolo della media dei conteggi C n i Esempio : a) Conta delle piastre in parallelo C 1 = 0 C = 9 b) Si calcola il K p che risulta essere pari a 1.9 c) Poiché la dispersione dei conteggi è accettabile si può esprimere il risultato come media dei due conteggi. Avremo pertanto:

25 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 5 di Prove con diluizioni successive In caso di prove dove sono previste delle diluizioni è necessario verificare preventivamente la proporzionalità delle diluizioni, ovvero valutare la dispersione dei dati con il G applicando la formula tratta dall Appendice A. della norma UNI ENV ISO 13843:003 Qualità dell acqua Guida per la validazione dei metodi microbiologici : dove: C 1, C, C n = conteggi ottenuti sullo stesso campione ai rispettivi rapporti relativi di diluizione R 1, R, R n C = Somma totale di tutti i conteggi R = Somma totale di tutti i rapporti relativi R n è il livello più basso della serie di diluizioni è posto uguale ad 1. Se ad esempio la serie di diluizioni decimali per tre livelli fosse la seguente: i corrispondenti rapporti di diluizione R corrisponderebbero rispettivamente a: R 1 =100; R =10; R 3 =1. Il valore del G n-1 sperimentale così ottenuto (indicato anche come χ sp) va confrontato con i valori del χ n-1 tabulato (vedi Tabella 3 sottostante) Tabella 3 Valori di χ p,n-1 per i gradi di libertà sino a n-1 = 7 e per i livelli di probabilità p, più utilizzati (0,95 e 0,99) n ,95 3,841 5,991 7,815 9,488 11,071 1,59 14,067 p 0,99 6,635 9,10 11,345 13,77 15,086 16,81 18,475 Se G n-1 χ n-1 la proporzionalità della diluizione è rispettata (al livello di probabilità considerato). Nel caso in cui si operi in doppio è necessario valutare anche la precisione attraverso il calcolo del K p (vedi paragrafo ). Verificata la proporzionalità delle diluizioni (G n-1 χ n-1) e, se si opera in doppio, la precisione (K p,0), il risultato del conteggio è ottenuto mediante il calcolo della media ponderata delle conte di due diluizioni successive, in cui almeno una piastra contenga 15 colonie. Si applica quindi la seguente formula tratta dalla ISO 718:1996: (1)

26 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 6 di 31 dove: ΣC V n 1 n d = somma delle colonie contate su tutte le piastre considerate a due diluizioni successive, di cui almeno una piastra contenga 15 colonie = volume in ml inoculato in ciascuna piastra = numero di piastre considerate alla prima diluizione = numero di piastre considerate alla seconda diluizione = fattore di diluizione corrispondente alla prima diluizione considerata Successivamente per individuare l intervallo di confidenza δ con una probabilità del 95%, che caratterizza la dispersione microbiologica del campione, si utilizza la seguente equazione: () dove: δ = intervallo di confidenza ΣC = somma delle colonie contate su tutte le piastre considerate di due diluizioni successive di cui almeno una contenga 15 colonie B = V (n 1 + 0,1n ) dalla equazione (1) 1,9 = fattore di correzione che tiene conto della non perfetta approssimazione della distribuzione di Poisson rispetto a quella normale 1.96 = variabile standardizzata K per p = 0.95 (K 0,95 ) d = diluizione corrispondente al primo inoculo considerato (diluizione della prima piastra presa in considerazione nella conta) Esempio 3: Rapporto relativo Diluizioni C di diluizione 1 C Sommatoria K p 0,95 1,96 G n-1 χ n-1 3, ,64 0, ,03 38 accettabili accettabile Poiché K p e G sono accettabili si può calcolare il numero delle colonie con il rispettivo intervallo di fiducia con la formula (1).

27 LABORATORIO DI SANITÀ PUBBLICA Pagina 7 di 31 Avremo pertanto: Diluizioni C 1 C C N = = 1( + 0,1 * ) * ,00 = Applicando gli arrotondamenti come da letteratura: N = 1,7 x 10-5 Per il calcolo dell intervallo di fiducia si applica la formula (): Dove B = V(n 1 + 0,1 n ) = 1( + 0,1()) =, Limite superiore: δ = [ ] = pari a 1,9 x 10 5 Limite inferiore: δ = [ ] = pari a 1,6 x ALIMENTI L i.d.m. è calcolata secondo l approccio olistico, basato sul calcolo degli scarti tipo di riproducibilità derivati dalle prove di ripetibilità di conteggio; come già detto, infatti, nelle prove microbiologiche la componente di ripetibilità è preponderante rispetto agli altri contributi che possono influire sull incertezza del risultato. Con questo tipo di approccio le variabili comprese dal protocollo sono: campione, terreni e reagenti, strumentazione, operatori, tempo, diluizioni, errori casuali. Il laboratorio effettua in momenti diversi, utilizzando operatori diversi, apparecchiature diverse in diversi stati di taratura, materiali di riferimento di lotti o di ditte diverse, prove di riproducibilità su un numero significativo di aliquote di una matrice certificata o di un campione omogeneo incrementato con materiali di riferimento a concentrazione nota, conservate in modo tale da mantenerne inalterate le caratteristiche (ad esempio mediante congelamento). Si calcola lo scarto tipo relativo di riproducibilità S R (o coefficiente di variazione CV) e si esprime l incertezza estesa come U = K x S R dove K è il fattore di copertura pari a, con probabilità del 95%. Prove inter-laboratorio - Lo scarto tipo di riproducibilità da prove inter-laboratorio può essere utilizzato per il calcolo dell incertezza solo se tutti i laboratori partecipanti hanno impiegato lo stesso metodo, sulla stessa matrice e per lo stesso parametro per il quale si intende calcolare l incertezza. In tal caso lo scarto tipo si ottiene dalla differenza tra il valore medio ottenuto dal laboratorio e il valore target ricavato dal circuito, diviso lo z-score.