Genetica Medica. Dr. Giulio Piluso

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1 Genetica Medica Dr. Giulio Piluso Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale Università degli Studi della Campania «Luigi Vanvitelli» Tel giulio.piluso@unicampania.it

2 Libri di Testo consigliati: G. Neri, M. Genuardi Genetica Umana e Medica. Edra - Masson, 3 a edizione THOMPSON & THOMPSON Genetica in Medicina. Idelson-Gnocchi, Edizione 2005 T. Strachan, A. Read Genetica molecolare umana. Zanichelli 2

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4 Di cosa si occupa La Genetica Medica si occupa dello studio delle malattie genetiche, ovvero di malattie la cui eziologia è riconducibile ad un alterazione del patrimonio genetico dell individuo. Come tali esse possono essere trasmesse da un individuo portatore di un gene mutato o affetto da una malattia genetica alla progenie. 5

5 Cosa si propone Porre una corretta diagnosi clinica, spesso risultato del contributo di aree mediche specialistiche diverse. Confermare, se possibile, la diagnosi clinica attraverso test genetici che consentano di identificare con certezza l alterazione causa della malattia. Fornire al malato ed ai suoi familiari adeguato supporto attraverso la valutazione del rischio riproduttivo e la consulenza genetica. 6

6 Finalità della Genetica Medica [...] aiutare le persone con uno svantaggio genetico e le loro famiglie a vivere e riprodursi nel modo più normale possibile e a prendere decisioni informate riguardo a questioni riproduttive o di salute. [...] aiutarle ad adattarsi alla loro condizione unica [...]. Deve essere data la massima priorità al benessere delle persone e rendere massimi i benefici per la loro salute. Proposta di linee guida internazionali sulle questioni etiche in genetica medica e nei servizi di genetica. Organizzazione Mondiale della Sanità,

7 Obiettivi del modulo didattico Che cos è il materiale genetico ed i principi che ne regolano la funzione. Organizzazione del genoma umano. Struttura e funzione dei cromosomi. Modalità di trasmissione dei caratteri ereditari. Alterazioni genetiche causa di malattia: Alterazioni cromosomiche. Mutazioni e loro significato. Altri meccanismi molecolari alla base di alcune malattie genetiche: Espansione di triplette Imprinting genomico Disomia uniparentale Esempi di malattie genetiche per i diversi meccanismi molecolari proposti. Tecniche d indagine molecolare. 8

8 Cos è il Genoma? Il genoma è l'intero patrimonio genetico di un organismo vivente. GENE Il genoma è "scritto" in un composto chimico chiamato DNA (DeoxyriboNucleic Acid, acido deossiribonucleico) Il DNA, identico per tutte le cellule di un individuo, è contenuto nel nucleo 9

9 Gli Acidi Nucleici Il DNA (acido desossiribonucleico) e l RNA (acido ribonucleico) sono macromolecole presenti in quasi tutte le cellule. L informazione genetica è registrata utilizzando un codice a tre basi (codice genetico) ed immagazzinata nel DNA che è utilizzato per sintetizzare l RNA da cui si ottiene la sintesi delle proteine. La struttura della molecola di DNA definisce e determina la sua funzione biologica. 10

10 J.Watson e F.CricK (Nobel, 1962) 11

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12 Struttura del DNA a doppia elica (1) La composizione in basi del DNA rispetta una regola fondamentale: La quantità di purine è uguale alla quantità di pirimidine. La quantità di adenina è uguale alla timina. La quantità di citosina è uguale alla guanina. Il DNA ha una struttura a doppia elica, costituita da due molecole (i filamenti di DNA) tenuti insieme da interazioni deboli (legami idrogeno) che si instaurano tra coppie di basi appaiate secondo lo schema... 14

13 Struttura del DNA a doppia elica 15

14 Replicazione del DNA Durante il processo di sintesi del DNA (replicazione), i due filamenti di DNA vengono srotolati da un elicasi e ciascun filamento di DNA dirige la sintesi di un nuovo filamento ad esso complementare. Si ottengono così due doppie eliche di DNA, ciascuna delle quali è identica alla molecola parentale. Poiché ciascuna elica di DNA contiene un filamento che apparteneva alla molecola parentale e un filamento neosintetizzato, si dice che il processo replicativo è semi-conservativo. La sintesi dei nuovi filamenti è catalizzata dalle DNA polimerasi in presenza di dntp. 16

15 Il Codice Genetico Considerando un codice a tre basi e i quattro diversi nucleotidi (G, A, T, C) esistono 64 (cioè 4 3 ) possibili codoni per i 20 diversi aminoacidi. Il codice genetico è quindi degenerato. Ciò significa che esistono più codoni che specificano lo stesso aminoacido. La degenerazione del codice genetico è uno dei maccanismi mediante il quale viene garantita l integrità dell informazione genetica. 19

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17 Struttura e funzione dei geni I geni sono le unità funzionali del genoma cellulare, la cui trascrizione e successiva traduzione determina l espressione di specifiche proteine. Nei geni degli eucarioti, la sequenza codificante è suddivisa i segmenti (esoni), che sono separati da sequenze interposte non codificanti (introni). L iniziale prodotto della trascrizione (trascritto primario), che comprende esoni e introni, va incontro ad un processo di maturazione posttrascrizionale indicato come splicing dell RNA. L espressione genica è regolata nei diversi tessuti e tipi cellulari e nei diversi momenti funzionali. 21

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19 Controllo dell espressione genica Il controllo dell espressione genica è ampiamente esercitato a livello trascrizionale. Classicamente il gene è stato considerato come un entità che codifica un singolo RNA o un prodotto polipeptidico, quindi come un unica unità trascrizionale. In realtà non sono infrequenti una varietà di eventi di maturazione alternativi che possono portare a prodotti differenti: Uso di promotori alternativi - Alcuni geni umani hanno due o più promotori alternativi, che determinano schemi di espressione specifici per determinati tipi cellulari. Splicing e poliadenilazione alternativi - Molti geni umani vengono sottoposti a splicing alternativo per produrre sequenze differenti di mrna che codificano isoforme proteiche e che possono essere tessuto specifiche. 23

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21 Un esempio di splicing alternativo estremo Il gene Dscam della D. Melanogaster contiene 4 regioni di splicing alternativo a livello degli esoni 4, 6, 9, 17. Lo splicing alternativo consente di ottenere ben differenti mrna che codificano per altrettante isoforme della proteina. Tale numero è 2-3 volte superiore al numero totale di geni presenti nel genoma di D. Melanogaster. 25

22 Organizzazione del genoma umano (1) Genoma umano è il termine utilizzato per descrivere l insieme delle informazioni genetiche contenute nel DNA delle cellule umane. In realtà esso comprende due genomi: Il complesso genoma nucleare, corrispondente a più del 99% del DNA cellulare 2001 La piccolissima frazione del genoma mitocondriale. Una considerevole proporzione del genoma umano (circa il 98%) è costituito da DNA non codificante. In esso si riconosce una cospicua quantità di DNA ripetitivo (moderatamente, mediamente e altamente ripetuto) 26

23 Organizzazione del genoma umano (2) ~3000 Mb (Genoma aploide) ~ Geni 27

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25 Genoma mitocondriale Sequenziato nel 1981 DNA circolare a doppia elica (16.6 Kb) Contiene 37 geni (28 elica H, 9 elica L): 22 geni per trna 2 geni per rrna (16S e 12S) 13 geni per peptidi I geni sono privi di introni Piccole differenze nel codice genetico Eredità materna 29

26 L autonomia limitata del genoma mitocondriale Componenti mitocondriali Genoma mitocondriale Codificati da: Genoma nucleare Componenti del sistema di Fosforilazione ossidativa 13 subunità 80 subunità I NADH deidrogenasi 7 42 II Succinato CoQ riduttasi 0 4 III Complesso del citocromo b-c IV Complesso della citocromo c ossidai 3 10 V Complesso dell'atp sintetasi 2 14 Componenti dell'apparato di sintesi proteica 24 RNA 79 proteine rrna 2 0 trna 22 0 Proteine ribosomiali 0 79 Altre proteine mitocondriale 0 Tutte 30

27 I Cromosomi Il genoma nucleare è suddiviso in 24 tipi diversi di molecole di DNA a doppio filamento, a ciascuna delle quali si associano gli istoni e altre proteine non istoniche a formare i cromosomi. Nell uomo esistono 24 diversi cromosomi, distinti in 22 autosomi 2 cromosomi sessuali X e Y La densità genica varia considerevolmente tra i diversi cromosomi e nell ambito di uno stesso cromosoma. Sebbene molti geni siano presenti nel genoma in unica copia, altri geni sono membri di famiglie geniche (prodotto di duplicazioni), con funzioni identiche o strettamente correlate. 31

28 Chr Total DNA (bp) Euchromatin (bp) 1 245,203, ,712, ,315, ,043, ,411, ,607, ,610, ,580, ,967, ,524, ,740, ,880, ,431, ,546, ,908, ,694, ,505, ,187, ,480, ,710, ,978, ,709, ,464, ,328, ,151,656 95,511, ,311,216 87,191, ,114,055 81,117, ,995,999 79,890, ,691,216 77,480, ,753,510 74,534, ,790,860 55,780, ,644,868 59,424, ,976,537 33,924, ,476,972 34,352,051 X 152,634, ,686,664 Y 50,961,097 22,761,097 32

29 Corredo cromosomico Il corredo cromosomico umano è costituito da 46 cromosomi: 22 coppie di cromosomi omologhi (gli autosomi) derivanti ciascuno da uno dei due genitori, e i due cromosomi sessuali (XX per la femmina e XY per il maschio). Le cellule somatiche hanno un corredo cromosomico diploide (2n), in cui sono presenti due copie di ciascun cromosoma. 33

30 Corredo cromosomico I gameti (spermatozoi e cellula uovo) sono invece cellule specializzate che hanno un numero di cromosomi aploide (n), contengono cioè una singola copia di ciascun cromosoma. Nella specie umana i gameti hanno 23 cromosomi: 22 autosomi e un cromosoma sessuale. Dalla fusione di due gameti (maschile e femminile) si forma lo zigote (diploide) da cui per successive divisioni cellulari si forma un nuovo individuo mantenendo inalterato l assetto cromosomico (46,XX, 46,XY ). 34

31 Impaccamento del DNA nei cromosomi 35

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33 Il ruolo dei cromosomi nella divisione cellulare I cromosomi hanno due funzioni correlabili alla divisione cellulare: Perpetuare il materiale ereditario durante lo sviluppo di un individuo. Rimescolare il materiale ereditario tra generazioni successive. Tali funzioni dei cromosomi sono strettamente dipendenti da alcune loro componenti: Centromero Telomeri Origini di replicazione Ciascun cromosoma possiede un unico centromero, identificabile citologicamente nella costrizione primaria, la cui funzione è essenziale per la migrazione dei cromosomi durante la mitosi e la meiosi. I telomeri costituiscono le estremità dei cromosomi. Essi sono strutture specializzate, costituite da DNA e proteine, che concorrono a garantire l integrità del cromosoma 37

34 Centromero Il centromero è la regione dove i 2 cromatidi fratelli restano uniti fino all anafase ed a cui si legano le fibre del fuso che ne guidano la migrazione ai poli. In metafase il centromero è visibile come costrizione primaria. Negli eucarioti, il centromero è normalmente marcato da una variante specifica dell istone H3 (Cen-H3) Nell uomo la variante è CENP-A Si estende per diverse Mb e contiene elementi di sequenza ripetuti. 38

35 Tipi di divisione cellulare: Mitosi e Meiosi La mitosi è il normale processo di divisione cellulare, dalla prima divisione dello zigote alla morte dell organismo. Nel corso della vita avvengono circa divisioni cellulari. La meiosi è invece limitata alle cellule della linea germinale. In essa si realizzano due successive divisioni cellulari precedute da un unica duplicazione del DNA. Il risultato sono cellule con corredo cromosomico aploide: i gameti. Esistono due differenze fondamentali tra mitosi e meiosi: I prodotti della mitosi sono diploidi, mentre quelli della meiosi sono aploidi. I prodotti della mitosi sono geneticamente identici, mentre quelli della meiosi sono geneticamente differenti. 39

36 Divisione cellulare n = num. di differenti cromosomi (23) C = contenuto di DNA [3,5pg (3,5x10-12 g) Interfase 2n 4C Mitosi 4n 4C 2n 2C 40

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38 Mitosi e Meiosi a confronto Mitosis Meiosis Location All tissues Only in testis and ovary Products DNA replication and cell division Extent of prophase Diploid somatic cells Normally one round of replication per cell division Short (~30 min in human cells) Haploid sperm and egg cells Only one round of replication but two cell divisions Meiosis I is long and complex; can take years to complete Pairing of homologs None Yes (in meiosis I) Recombination Relationship between daughter cells Rare and abnormal Genetically identical Normally at least once in each chromosome arm Different (recombination and independent assortment of homologs) 42

39 Assortimento indipendente degli omologhi paterni e materni Durante la meiosi I, gli omologhi materno e paterno di ciascun cromosoma si appaiono formando un bivalente. Ogni cromosoma è in questa fase costituito da due cromatidi fratelli prodotti della duplicazione del DNA, pertanto ciascun bivalente è costituito da quattro molecole di DNA a doppia elica. Per ogni coppia di omologhi, la scelta di quale cromosoma (materno o paterno) migrerà in una o l altra delle cellule figlie è del tutto casuale (assortimento indipendente). Soltanto come conseguenza dell assortimento indipendente un singolo individuo può produrre 8,4x10 6 gameti differenti. 43

40 La ricombinazione (crossing-over) Nella profase della meiosi I si distinguono diversi stadi. Allo stadio di zigotene, ogni coppia di omolghi forma il complesso sinaptonemale in cui i due cromosomi sono saldamente appaiati da una struttura proteica centrale. Nello stadio successivo di pachitene ha luogo la ricombinazione (crossing-over). La ricombinazione vede una interruzione fisica della doppia elica di due cromatidi non fratelli e la loro riunione con scambio di porzioni variabile dei due cromatidi. I due omologhi risultano tra loro connessi a livello di specifici punti detti chiasma, espressione dell avvenuto crossing-over. La ricombinazione e l assortimento indipendente dei cromosomi omologhi consentono ad un singolo individuo di produrre un numero pressoché illimitato di gameti geneticamente differenti.. 44

41 Appaiamento X-Y Nel maschio, c è il problema dell appaiamento in Meiosi I dei cromosomi sessuali. Il cromosoma X è molto diverso dall Y. I cromosomi X e Y si appaiano solo all estremità e non per tutta la lunghezza grazie a brevi regioni di omologia (pseudoatosomal regions; PAR) PAR1 2.6 Mb all estremità del braccio corto del chr X PAR Mb all estremità del braccio lungo del chr X I geni presenti in queste regioni: Presentano copie omologhe sul chr X e Y Nella maggior parte, non sono sottoposti ad inattivazione trascrizionale a seguito della condensazione di una delle X nelle cellule somatiche femminili (X-inactivation) 45

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43 Spermatogenesi Primary spermatocyte Gli spermatociti primari vanno in contro a meiosi La meiosi dura circa 64 gg Nel maschio la produzione di gameti è continua dalla pubertà fino ad età avanzata. 47

44 Oogenesi Gli oociti primari iniziano la meiosi durante la vita fetale e si arrestano alla profase I fino alla pubertà La divisione cellulare è sempre asimmetrica e il citoplasma è tutto raccolto in una singola cellula Dopo la pubertà un solo oocita riprende la divisione ad ogni ciclo mestruale e si arresta metafase II Con l ovulazione e la fertilizzazione, la meiosi si completa con l emissione del secondo corpo polare. L arresto della meiosi può durare anche 50 anni. 48

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