Attivazione/repressione trascrizionale a lungo raggio: raggio: Altro meccanismo per reprimere la trascrizione: la metilazione del DNA

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1 Attivazione/repressione trascrizionale a lungo raggio:! Le regioni di controllo di un locus (Locus Control Regions LCR)! Le regioni di attacco alla matrice nucleare (MAR)! Gli isolatori Attivazione/repressione trascrizionale a lungo raggio:! Regioni cromosomali trascrizionalmente attive (eucromatina)! Regioni cromosomali trascrizionalmente inattive (eterocromatina)! Fenomeno del silenziamento posizionale o eterocromatizzazione! MECCANISMO? Metilazione del DNA Altro meccanismo per reprimere la trascrizione: la metilazione del DNA Nei vertebrati la metilazione interessa solamente la Citosina sul dinucleotide CpG : l enzima citosina metiltransferasi aggiunge un gruppo metile al C5 della citosina:il risultato è la 5- metilcitosina. Human Molecular Genetics 2

2 Metilazione del DNA! Le sequenze CpG sono sotto-rappresentate nel genoma (probabilmente per la tendenza della 5-metilcitosina a venire deaminata e mutata in T)! In cellule non embrionali, 80% dei CpG sono metilati, ad eccezione delle isole CpG dei promotori! Dnmt1 ha particolare affinità per le sequenze emi-metilate: tende quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo metilato-> mantenimento del pattern di metilazione! ma abbondanti nelle regioni promotrici dei geni Fasi di metilazione:! Metilazione differenziale de novo (Dnmt3a e Dnmt3b); La metilazione è regolata durante lo sviluppo: Demetilazione (natura sconosciuta delle demetilasi); Mantenimento della metilazione e trasmissione alle cellule figlie (Dnmt1). Demetilazione passiva

3 Metilazione e regolazione genica: Le principali funzioni della metilazione sono collegate alla repressione della trascrizione:! Difesa contro i trasposoni: la metilazione e fondamentale per mantenere silenti i genomi dei trasposoni e dei retrotrasposoni! Le Dnmts metilano il DNA! Il DNA metilato è legato da proteine che legano il metile (MeCP2, MBD1-4)! Queste a loro volta sono in grado di reclutare diversi HDAC -> repressione della trascrizione! Regolazione genica: la metilazione contribuisce a stabilire e mantenere uno stato trascrizionalmente inattivo (eterocromatina)

4 Modificazioni epigenetiche:! Modificazioni ereditabili che non alterano la sequenza nucleotidica dei geni ma ne alterano l attivita : Trascrizione, modificazioni epigenetiche e cancro! Acetilazione degli istoni della cromatina! Metilazione del DNA Lo sviluppo di neoplasie comporta sempre anomalie nell espressione genica: Fattori di trascrizione come oncogeni. Esempio: attivazione inserzionale del proto-oncogene c-myc c) Attivazione tramite traslocazione nel gene della catena pesante delle Ig t(8;14) -> LINFOMA DI BURKITT

5 Fattori trascrizionali come onco-soppressori. Esempio: p53 L importanza delle acetilasi degli istoni: CBP/p300 La stabilizzazione di p53 causata da danno al DNA induce l espressione di p21, un inibitore delle cinasi ciclina-dipendenti l inibizione dell attivita cinasica delle cicline Cdk1, 2, 4 e 6 provoca arresto del ciclo cellulare L assenza di CBP nel topo causa lo sviluppo di tumori ematologici (simile alla sindrome Rubinstein-Taybi, associata all inattivazione dell attivita enzimatica di CBP) Gli oncogeni virali SV40 large T e E1A dell adenovirus bloccano CBP e necessitano di questa attivita per trasformare le cellule: coinvolgimento di p53? Possibile meccanismo: ridotta attivita di p53

6 Il virus oncogeno HTLV-1 necessita di CBP per attivare la trascrizione del suo genoma: Acetilazione aberrante nel cancro:coinvolgimento sia di HAT che di HDAC HAT:! Geni codificanti per diverse HAT si trovano traslocati, amplificati, sovraespressi e/o mutati in diversi tipi di tumori, sia ematologici che epiteliali! Mutazioni missenso o associate a p300 tronca NON FUNZIONALE si trovano associate a tumori del colon/retto e gastrici (secondo allele deletato)! Gli individui con sindrome di Rubinstein-Taybi portano una mutazione che inattiva l attività HAT di CBP -> aumentato rischio di tumori! L 80% dei glioblastomi mostra associazione con perdita di eterozigosi per p300! perdita di eterozigosi attorno al locus di CBP è associata a carcinomi epatocellulari.! Traslocazioni di p300 e CBP risultanti in fusioni in frame con diversi geni -> associate a diversi tumori ematologici

7 HDAC e cancro HDAC:! Leucemia acuta promielocitica (APL): PML-RAR!, l oncoproteina generata da una fusione per traslocazione cromosomica del gene codificante l attivatore trascrizionale RAR! con il dominio di repressione del gene PML, reprime i geni normalmente attivati da RAR! mediante metilazione e reclutamento di un co-repressore contenente attività HDAC! Uno squilibrio nell acetilazione degli istoni può quindi causare alterazioni della struttura della cromatina e regolazione aberrante di geni coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, del differenziamento e/o dell apoptosi! Linfoma non-hodgkin: il repressore trascrizionale LAZ3 è anormalmente sovraespresso e causa repressione trascrizionale aberrante (HDAC dipendente) con conseguente trasformazione tumorale! La leucemia acuta mieloide M2 è associata con t(8;21) che genera una proteina di fusione AML1/ETO che agisce come un potente repressore trascrizionale dominante tramite reclutamento di HDAC Inibitori delle HDAC: una nuova terapia anti-cancro! Diverse sostanze che causano differenziamento, arresto della crescita e/o apoptosi di cellule trasformate -> inibitori di HDAC (es. DMSO, Tricostatina A (TSA), butirrato)! Questi inibitori causano arresto del ciclo cellulare in G1 o G2, differenziamento e/o apoptosi in vitro, documentati in tutti i tipi cellulari trasformati incluse linee cellulari derivate sia da tumori ematologici (leucemie, linfomi, mielomi) che epiteliali (tumore dei polmoni, delle ovaie, del seno, della prostata)! SI IGNORA quali siano gli HDAC la cui attività deve essere bloccata! Gli inibitori causano aumento dell acetilazione sugli istoni (H2A, H2B, H3 e H4) anche in cellule normali, ma l attività di soppressione della crescita sembra essere limitata alle cellule trasformate.! Geni bersaglio:! CDKN1A (codificante per l inibitore dell attività cinasica ciclinadipendente p21/waf1) (tramite un sito di SP1 sul promotore)! CDKN2A (p16)! Ciclina E! Le concentrazioni biologicamente attive correlano con quelle richieste per causare accumulazione di istoni acetilati

8 Metilazione, regolazione genica e cancro:! Il pattern di metilazione dei geni è alterato nelle cellule tumorali, e metilazione alle isole CpG di certi geni è associata al loro silenziamento specifico (es. PML-RAR lega il promotore del gene RAR" e causa il reclutamento di DNMT -> metilazione -> MBD -> HDAC)

9 Cooperatività tra inibitori di HDAC e di DNMT Modificazioni epigenetiche, trascrizione e ambiente! 5-aza-2 -desossicitidina (inibitore di DNMT1) -> ipometilazione e riattivazione di soppressori di tumori silenziati! Può cooperare con inibitori delle HDAC quali TSA! Con potenziale riduzione delle dosi richieste e della tossicità, e minori possibilità di insorgenza di meccanismi di resistenza! In quanto reversibili, i cambiamenti epigenetici possono essere modificati dall ambiente! Sia ipo- che iper-metilazione sono stati associati all invecchiamento (perdita generica di metilazione, ipermetilazione di geni specifici: silenziamento di soppressori tumorali?)! Vitamine quali l acido folico, che sono importanti per l attività degli enzimi che forniscono gruppi metilici, hanno effetti notevoli sull incidenza di tumori quali il cancro al colon! Dieta scarsa in folati -> instabilità genomica e ipometilazione! Dieta scarsa di gruppi metilici -> cancro del fegato, e ipometilazione+sovraespressione di oncogeni (c-ras, c-myc, c-fos)