CICLO CELLULARE 11/12/17 BIOTECNOLOGIE CICLO CELLULARE

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1 CICLO CELLULARE Le cellule si riproducono svolgendo una sequenza ordinata di eventi in cui duplicano il loro contenuto e poi si dividono in due cellule figlie, per cui tutte le cellule derivano da altre cellule. Questo ciclo di duplicazione e divisione prende il nome di CICLO CELLULARE CICLO CELLULARE BIOTECNOLOGIE NELLE SPECIE UNICELLULARI come procarioti ed eucarioti unicellulari (es. lieviti come S. cerevisiae), ciascuna divisione cellulare produce un nuovo organismo completo. NELLE SPECIE PLURICELLULARI, lunghe e complesse sequenze di divisioni cellulari sono necessarie per produrre un nuovo organismo. Anche nell adulto le divisioni cellulari sono, di solito, necessarie per sost i t ui r e le cellule che muoiono In model bacterial systems such as E. coli and Bacillus subtilis, cell-cycle timing of cytokinesis may be analogous to the timing of replication initiation; there is a dependence on other cell-cycle processes, but no dedicated cell-cycle control system has yet been discovered

2 FASI DEL CICLO CELLULARE Fasi del ciclo cellulare: Il ciclo cellulare comprende DUE GRANDI FASI: la FASE M, durante la quale la cellula si divide in due cellule figlie e l INTERFASE che comprende il tempo che intercorre tra due fasi M, cioè fra una divisione cellulare e la successiva. L INTERFASE non rappresenta, un lungo periodo di riposo più o meno lungo della cellula (necessario per aumentare il suo volume), ma un periodo di delicati processi di preparazione alla divisione. L interfase comprende TRE STADI: - stadio G1 (GAP 1) - stadio S (SINTESI DNA) - stadio G2 (GAP 2) Durante l interfase si ha l accrescimento e la divisione dei componenti cellulari. 7 Lo stadio G1 è quello che occupa la maggior parte della durata di tutto il ciclo cellulare. Esso termina nel momento in cui inizia la fase S di sintesi del DNA. Dopo la replicazione di tutto il DNA e cioè dopo che tutti i cromosomi sono stati duplicati in due cromatidi, perfettamente uguali cromatidi fratelli,, la cellula entra nello stadio G2 per un breve periodo di tempo, al termine del quale inizia la mitosi. 8 Dopo la fase M in cui si sono avute la Mitosi e la Citochinesi le cellule figlie entrano nuovamente nell interfase che inizia con lo stadio G1 durante la quale riprendono a velocità elevata le attività biosintetiche della cellula. In G1 vengono sintetizzate tutte le proteine, i carboidrati, i lipidi della cellula e sintetizzati gli organuli (fase in cui il metabolismo cellulare è fortemente attivo). Nello stadio G2 i cromosomi si condensano (sono visibili al microscopio ottico), avviene la duplicazione dei centrioli. La durata totale del ciclo può variare da alcune ore ad anni a seconda della cellula. L interfase occupa circa il 90% del tempo. La fase M dura circa 1-2 h Nella fase G 0 le cellule sono non proliferanti in uno stato di quiescenza che può essere reversibile o meno a seconda dei casi. G 0 Durante tutto il ciclo e soprattutto durante la fase G 1 le cellule accrescono le proprie dimensioni fino ad arrivare alla divisione. 11 Table 18-1 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010) 12 2

3 FASE G 1 - FASE G 0 La fase G1 è importante per il controllo dell ambiente intra ed extracellulare. La sua lunghezza può variare molto in funzione delle condizioni esterne e dei segnali che provengono da altre cellule. Se le condizioni non sono favorevoli, le cellule possono ritardare molto questa fase e possono anche entrare in uno stato di riposo specializzato: fase G 0 in cui possono rimanere per giorni, mesi, anni prima di riprendere la proliferazione cellulare. Molte cellule rimangono permanentemente in G 0 fino alla morte dell organismo. Si tratta p.e. delle cellule del muscolo scheletrico (il loro sistema di controllo del ciclo cellulare è stato smantellato, i relativi geni (cicline CDK) sono spenti permanentemente, la divisione cellulare non avviene mai. Altre cellule, p.e. epatiche, sono in G 0 ma possono essere stimolate, se il fegato è danneggiato, a dividersi. 13 IN CHE MODO SI PUO STABILIRE LO STADIO DEL CICLO CELLULARE IN CUI SI TROVA UNA CELLULA? MISURA DEL CONTENUTO DI DNA. SI TRATTANO LE CELLULE CON MOLECOLE CHE DIVENTANO FLUORESCENTI QUANDO LEGATE AL DNA. LE FLUORESCENZA VIENE RILEVATA DAL CITOFLUORIMETRO 14 Contenuto di DNA cromosomico (C) umano durante il ciclo cellulare 15 CARIOTIPO UMANO (2N) CROMOSOMI OMOLOGHI: SONO DIVERSI, UNO DI DERIVAZIONE MATERNA, UNO DI DERIVAZIONE PATERNA Quando una cellula deve dividersi, duplica il proprio DNA e quindi i cromosomi diventano così: 17 Cioè ciascun cromosoma omologo diventa a farfalla, formato da due cromatidi che sono IDENTICI xchè derivano dalla duplicazione del DNA. Questi cromatidi si chiamano FRATELLI 18 3

4 Untreated cells Treated cells Una popolazione NON sincronizzata di cellule in crescita quando trattata con DAPI presenta una distribuzione bimodale. Quindi la misura della quantità del DNA delle cellule della popolazione dà indicazioni sulla distribuzione delle cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare FASE G 1 - FASE G 0 Se le condizioni sono favorevoli, le cellule in G1 o G 0 progrediscono attraverso un punto di impegno vicino alla fine di G1 detto In presenza di MITOGENI (fattori di crescita) molecole segnale extracellulare, che possono stimolare la cellula a crescere e proliferare, la cellula procede nel ciclo cellulare verso la fase S. START (nei lieviti) o PUNTO DI RESTRIZIONE (nei mammiferi). Superato questo punto, anche se i segnali extracellulari che stimolano la crescita e la divisione cellulare vengono rimossi, le cellule sono impegnate nella replicazione del DNA (S). Quindi non bastano i nutrienti per la proliferazione cellulare, ma occorrono specifici segnali extracellulari Sistema di controllo del ciclo cellulare Deve coordinare crescita e divisione cellulare con segnali di origine interna ed esterna. start Per lo start nei mammiferi sono importanti segnali extracellulari: MITOGENI 23 Punti di controllo (checkpoint) del ciclo cellulare: 1) Passaggio G 1 /S 2) Passaggio G 2 /M 24 4

5 Sistema di controllo del ciclo cellulare Le cellula deve controllare e coordinare due insiemi di proteine: Quelle deputate a sintetizzare i nuovi componenti della cellula Quelle deputate a distribuirle correttamente tra le due cellule 25 Il ciclo cellulare è sotto il controllo di segnali chimici presenti nel citoplasma 26 The Nobel Prize in Physiology - Medicine 2001 The Nobel Assembly at Karolinska Institutet has awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine jointly to Leland Hartwell, Tim Hunt and Paul Nurse for their discoveries of "key regulators of the cell cycle". Using genetic and biochemical methods, they identified the molecules CDK and cyclin that control the cell cycle in eukaryotic organisms. These fundamental discoveries have a profound impact on many aspects of biology and medicine. CDK and cyclin are key molecules that control and coordinate DNA-synthesis, chromosome separation and cell division. CDK and cyclin together drive the cell from one cell cycle phase to the next. 27 Un modo per regolare l attivita delle proteine consiste nella FOSFORILAZIONE (effettuata da proteine CHINASI) e nella DEFOSFORILAZIONE (effettuata da proteine FOSFATASI). Cuore del sistema di controllo del ciclo cellulare è una famiglia di proteine CHINASI (in grado di fosforilare specifiche proteine) note come CHINASI DIPENDENTI DA CICLINA (CDK). Es. Un aumento dell attività di Cdk all inizio della mitosi porta all aumentata fosforilazione di proteine che controllano gli eventi della mitosi (condensazione dei cromosomi, demolizione dell involucro nucleare..) 28 Come viene regolata l attività delle CHINASI DIPENDENTI DA CICLINA (CDK)? Le proteine fondamentali per la regolazione delle Cdk sono le CICLINE, anche se esistono numerosi altri enzimi e proteine coinvolti in questo processo 29 Le Cdk sono strettamente dipendenti dalle cicline per la loro attività: hanno attività chinasica, quindi possono fosforilare le proteine bersaglio, solo se sono strettamente legate ad una ciclina 30 5

6 Ci sono QUATTRO CLASSI DI CICLINE, ciascuna definita dallo stadio del ciclo cellulare in cui si lega alla Cdk e svolge la sua funzione Tre di queste classi sono NECESSARIE IN TUTTE LE CELLULE EUCARIOTICHE: le cicline G1/S le cicline S le cicline M Nella maggior parte delle cellule, una quarta classe di cicline, le cicline G1, aiutano a promuovere il passaggio attraverso lo Start o il punto di restrizione alla fine di G1. 31 Nelle cellule di lievito una singola Cdk lega tutte le cicline, cambiando ciclina partner a stadi diversi del ciclo. Nei vertebrati ci sono quattro Cdk diverse. Ciascun complesso ciclina-cdk fosforila una serie diversa di proteine-substrato. 32 Mentre i livelli di Cdk sono costanti nel ciclo cellulare, le cicline subiscono un ciclo di sintesi e degradazione durante ogni ciclo cellulare. Come si degradano le cicline Due proteine UBIQUITINA LIGASI sono importanti nella distruzione delle cicline I complessi ciclina-cdk sono completamente attivi dopo che le Cdk sono state fosforilate da CHINASI CHE ATTIVANO LE CDK (CAK)

7 stop PROTEINE INIBITRICI DELLE CDK (CKI) Il controllo puo avvenire in varie fasi del ciclo cellulare. Questo puo essere bloccato in risposta a vari segnali grazie all intervento di PROTEINE INIBITRICI DELLE CDK (CKI) ATTIVAZIONE DI M-CDK MEDIANTE FEEDBACK POSITIVO I RECETTORI TIROSIN CHINASICI ATTIVANO LA PROTEINA RAS (proteina monomerica che lega il GTP) Anche G1/S-Cdk e G1-Cdk

8 FATTORI TRASCRIZIONALI Meccanismi che controllano l inizio della fase S nelle cellule animali Il controllo G1 / inizio S è alterato spesso in cellule cancerose portando ad una proliferazione incontrollata. Regolazione G1-CDK nei mammiferi mediata da un fattore trascrizionale E2F, che si lega al DNA nel promotore di geni target e attiva l espressione di geni tra cui quelli per le cicline G1/S e S. La funzione di E2F è controllata dalla proteina retinoblastoma (Rb), un inibitore della progressione del ciclo cellulare. In G1, Rb si lega ad E2F e blocca la trascrizione dei geni target. Se le cellule sono stimolate a dividersi da segnali extracellulari, G1-CDK si attiva, fosforila Rb riducendo l affinità di binding per E2F, attivando i geni per la fase S Inizio della replicazione del DNA: una sola volta per ciclo cellulare Il danno al DNA arresta il ciclo cellulare Il danno al DNA può bloccare il ciclo cellulare sia in G1 che in G2. Nei mammiferi, se il DNA è danneggiato, in G1 viene attivato un fattore trascrizionale: p53, che stimola la trascrizione di molti geni target. Uno di questi geni codifica una proteina CKI detta p21 che si lega a G1/S-CDK e S-CDK inibendone l attività. Nelle cellule non danneggiate, p53 è presente a livelli bassi perché interagisce con Mdm2, una ubiquitina ligasi, e viene quindi degradata nel proteasoma. Il danno al DNA attiva delle proteine chinasi che fosforilano p53 riducendo l affinità di binding per Mdm2. Ciò fa diminuire la degradazione di p53, attivazione di p21, blocco di G1/S-CDK e S-CDK, blocco del ciclo cellulare

9 P53: IL GUARDIANO DEL GENOMA P53: IL GUARDIANO DEL GENOMA p53 è un potente fattore di trascrizione. p53 regola l espressione di oltre 300 geni. p53 è una proteina nucleare di 55kDa

10 Cosa succede se il DNA è molto danneggiato da non poter essere riparato? UNICELLULARI: arresto temporaneo del ciclo cellulare PLURICELLULARI: le cellule vanno incontro a MORTE CELLULARE PROGRAMMATA o APOPTOSI. Questa decisione dipende dall attivazione di p53 ed è questa funzione di p53 che sembra essere importante come protezione contro il cancro APOPTOSI ) Rimodellare le strutture dell organismo APOPTOSI Es. formazione delle zampe di Mus musculus In un organismo cellulare le cellule fanno parte di una comunità. Quando non sono più necessarie si suicidano fenomeno definito morte cellulare programmata o apoptosi. Si tratta di un processo attivo che richiede energia, trascrizione genica e sintesi proteica e risulta dal bilancio tra i segnali di morte e di sopravvivenza. 2) Eliminare strutture non più utili Es. coda del girino (Pelophylax esculentus) A cosa serve l apoptosi? L apoptosi può essere innescata tramite due vie: la VIA ESTRINSECA o recettoriale e la VIA INTRINSECA o mitocondriale Le cellule che subiscono un danneggiamento esplodono, rilasciando i loro componenti cellulari e causando spesso infiammazione:parliamo allora di necrosi cellulare Nell apoptosi le cellula muore in modo pulito. Si frammenta il suo DNA e il citoscheletro collassa. La cellula cambia l asimmetria della membrana plasmatica (esternalizzazione della fosfatidilserina) segnalando così ai macrofagi che devono fagocitarla

11 Il doppio strato lipidico ha composizione asimmetrica che differisce a seconda del tipo di membrana ESTERNALIZZAZIONE DELLA FOSFATIDILSERINA Per quanto riguarda le caratteristiche biochimiche, la morte programmata è caratterizzata dall esternalizzazione della fosfatidilserina ad opera della flippasi e dall attivazione di enzimi come le caspasi (che sono proteasi iniziatrici ed effettrici) attivate in seguito ad auto-clivaggio e responsabili, a loro volta, del clivaggio di substrati a valle L apoptosi è mediata dalla cascata proteolitica autoamplificante di proteasi chiamate caspasi. E necessario lo stretto controllo di questa cascata essendo i suoi effetti irreversibili Le caspasi, oltre a degradare direttamente le proteine del citoscheletro, attivano una DNasi citoplasmatica che produce una caratteristica frammentazione del DNA: PROFILO A SCALETTA

12 Tumori e genetica/epigenetica Differiscono dalle altre malattie genetiche perché le mutazioni associate sono spesso mutazioni somatiche, che colpiscono singole cellule in un organismo a completo sviluppo. Quasi tutti gli agenti identificati come corresponsabili della trasformazione tumorale sono MUTAGENI. Quasi tutti i tumori umani non solo contengono molte mutazioni ma sono anche INSTABILI GENETICAMENTE: mutazioni che interferiscono con una replicazione accurata del genoma GENI CHE REGOLANO LA DIVISIONE CELLULARE Mutazioni, modificazioni epigenetiche Ø Geni il cui prodotto proteico promuove un aumento del numero di cellule (oncogeni) Oncogeni = acceleratori Proto-ONCOGENI ATTIVATI ONCOSOPPRESSORI Ø Geni il cui prodotto proteico induce una riduzione del numero di cellule (oncosoppressori). Oncosoppressori = freni Trasformazione neoplastica ONCOSOPPRESSORI: DEFINIZIONE PROTO ONCOGENI E GENI ONCOSOPPRESSORI Geni che, attraverso alterazioni genetiche o epigenetiche, subiscono una perdita di funzione. Agiscono quindi in maniera recessiva (un singolo allele non e capace di produrre l effetto oncogenico). La maggior parte di questi geni codifica per proteine coinvolte in vari meccanismi di controllo della crescita e della sopravvivenza cellulare Si ritiene che gli oncogeni sono tutti quei geni che, attraverso un guadagno di funzione, a seguito di mutazioni attivanti, contribuiscono alla trasformazione e progressione neoplastica. Il contributo agli stessi fenomeni da parte dei geni oncosoppressori si realizza mediante una perdita di funzione, a seguito di mutazioni inattivanti

13 MUTAZIONI DOMINANTI (RAS) TUTTI I RECETTORI TIROSIN CHINASICI ATTIVANO LA PROTEINA RAS (proteina monomerica che lega il GTP) MUTAZIONI RECESSIVE (p53-rb) UN ESEMPIO DI ONCOSOPPRESSORE: p53 P53: IL GUARDIANO DEL GENOMA Risulta mutato in una grande percentuale di tumori umani. Circa il 95% dei tumori presenta mutazioni nella molecola p