RELAZIONE SULLO STAGE AL DIFI SEZIONE DI BIOFISICA

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1 Autera Simone De Martini Valentina Liggieri Giovanni RELAZIONE SULLO STAGE AL DIFI SEZIONE DI BIOFISICA TUTORS: Francesca Pellistri, Silvia Siano, Andrea Gallo 27/02-03/03/ 2006 Lo stage al DIFI (Dipartimento di Fisica dell Università di Genova) si è articolato in attività pratiche nei laboratori di ricerca dell università e in un ciclo di seminari pomeridiani, sostenuti da professori della facoltà, in merito a materia e antimateria, biofisica e nanotecnologie. Le esperienze di laboratorio a cui abbiamo assistito e partecipato si sono svolte nella sezione di biofisica, ossia quella branca della fisica che si occupa di spiegare, secondo principi fisici e chimici, le funzioni biologiche studiando le proprietà e le strutture delle molecole. In particolare l attività suddetta consiste in due differenti tipologie di indagine inserite in una ricerca già in atto sull effetto di alcune proteine sui neuroni. Misure di fluorescenza Consiste in una serie di esperimenti effettuati tramite l uso di un microscopio in fluorescenza in grado di rivelare la variazione di concentrazione di calcio in neuroni trattati con proteine amiloidi. Questi tipi di proteine, coinvolte in molte patologie, formano aggregati che si pensa creino pori nella membrana della cellula, permettendo l ingresso incontrollato di ioni calcio, con esiti tossici per la cellula. Per effettuare le prove, abbiamo trattato il campione con Oregon Green 6µM, una sonda fluorescente che si lega al calcio. In particolare l Oregon Green si eccita in uno spettro piccato a 520nm ed emette a 460nm, perciò sul microscopio è montato un particolare filtro che seleziona tali lunghezze d onda tra quelle emesse dalla lampada a mercurio. Misurando la variazione di 1

2 fluorescenza nel tempo, è possibile misurare le variazioni nella concentrazione di ioni Ca 2+ nella cellula. Le misure sono state effettuate in diverse condizioni con la proteina batterica HypF non patogena ma che può formare aggregati amiloidi se trattata. Uno degli obiettivi di questa ricerca è infatti dimostrare che è lo stato di aggregazione e non la proteina stessa a determinarne la tossicità. Abbiamo trattato le cellule (neuroni estratti da cervelletto di ratto di 7 giorni) con: 1. Soluzione fisiologica esterna standard + proteina in concentrazione 0,2 µm aggregata per 24h 2. Soluzione fisiologica esterna a 0 calcio + proteina 0,2 µm 3. Soluzione fisiologica esterna con Cadmio 50 µm + proteina 0,2 µm Le stesse prove sono state ripetute con diverse concentrazioni delle proteina (doppia e decupla) e con l HypF fatta aggregare per 48 h. La soluzione fisiologica standard è composta da: NaCl 135mM, KCl 54mM, CaCl 2 1,8mM, MgCl 2 1mM, Hepes 5mM, Glucosio 10mM, NaOH 2mM. Il PH della soluzione è 7,4. I risultati sono riportati e analizzati nei seguenti grafici che riportano alcune delle prove eseguite. Un unità sull ascissa corrisponde a 0,5 secondi mentre in ordinata è riportata l intensità della fluorescenza in unità arbitraria. Il grafico evidenzia un rapido aumento della concentrazione del calcio. Si può ipotizzare che la proteina crei nel giro di pochi secondi un nuovo canale nella membrana che permette l ingresso incontrollato di ioni calcio. 2

3 Aumentando la concentrazione della proteina notiamo un cambiamento nella coda del grafico dettata da una maggior permanenza di calcio nella cellula. Questo può dipendere da una quantità di calcio da smaltire superiore alla capacità delle pompe del calcio, di conseguenza il tempo di smaltimento sarà maggiore. 3

4 Possiamo notare che un ulteriore aumento della concentrazione provoca anche un ancora maggiore allungamento del tempo di smaltimento degli ioni calcio. Abbiamo effettuato due prove di controllo con soluzione fisiologica a 0 calcio e soluzione fisiologica con cadmio. 4

5 La prima ha rivelato che la proteina non ha effetto: questo significa che l aumento di calcio rilevato nelle prime prove deriva da un ingresso di calcio nella cellula dall esterno, e non da un rilascio interno degli istori. Inoltre, il cadmio blocca i canali al calcio endogeni del neurone,. Il fatto che la reazione avvenga comunque indica che le proteine funzionano generando un nuovo canale e non inducendo l ingresso di calcio tramite i normali canali endogeni. Tecnica del Patch Clamp Il patch clamp è un metodo per la registrazione delle debolissime correnti ioniche che fluiscono attraverso i canali voltaggio-dipendenti della membrana cellulare. Consiste nell isolare elettricamente un frammento (patch) di membrana e nel registrare la corrente che vi passa attraverso. Per fare questo la punta di un microelettrodo di vetro riempito con una soluzione salina viene portato a contatto con la membrana della cellula. Applicando una leggera suzione si crea un sigillo (la resistenza del sigillo è dell ordine dei GΩ). A questo punto si procede a rompere la membrana. Il frammento di membrana ora contenuto nell elettrodo è rappresentabile con un circuito RC. La membrana cellulare è assimilabile a un conduttore elettrico con resistenza R m e capacità C m. R m dipende dal numero e dalla permeabilità dei diversi canali ionici. C m dipende invece dalle proprietà del doppio strato fosfolipidico, che è assimilabile alle due armature di un condensatore. La corrente raccolta dal microelettrodo viene inviata ad un amplificatore e poi registrata. Variando i valori di potenziale all interno della pipetta è possibile studiare le caratteristiche elettriche di diversi canali voltaggio-dipendenti, attivati da stimoli elettrici o chimici. L esperienza da noi osservata prevedeva la registrazione di correnti al Cloro. In particolare abbiamo fornito il neurotrasmettitore GABA al suo recettore specifico, stimolandolo. L attacco del neurotrasmettitore al suo recettore provoca l apertura del canale, l entrata di ioni cloro e la conseguente iperpolarizzazione della membrana. 5

6 Modello tridimensionale del Recettore GABA 6