23/11/17. I diversi 4pi di mutazioni. Sistema di riparazione del DNA. Origine delle mutazioni. Mutazioni e riparazione del DNA

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1 Mutazioni e riparazione del DNA Variazioni permanen4 della sequenza del DNA si definiscono mutazioni. Le mutazioni hanno permesso la diversificazione degli organismi viven4, ma a breve termine sono spesso deleterie. Le sistemi di riparazione del DNA che cellule hanno evitano l accumulo di numerose mutazioni. I diversi 4pi di mutazioni Mutazioni geniche (o puntiformi) Mutazioni cromosomiche Mutazioni nel numero dei cromosomi Mutazioni nella struttura Mutazioni geniche Le mutazioni geniche puntiformi sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA* con un altra Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita (delezione) o alla inserzione di una base nel filamento del DNA Sostituzione Delezione Inserzione *Se la mutazione avviene nell RNA la conseguenza sono alcune centinaia di molecole di proteina alterata sulle migliaia di copie che esistono in ogni cellula Le mutazioni possono avere gravi conseguenze Es. anemia falciforme: malaea gene4ca (mutazione proveniente dalle cellule germinali) GLU VAL Origine delle mutazioni Le mutazioni possono originarsi da appaiamen4 non corree durante la replicazione. Il tasso di errore è di 1 nucleo4de errato su 10 7 incorpora4. Con il sistema di riparazione del DNA si arriva a tasso di errore è di 1 nucleo4de errato su 10 9 incorpora4. La riparazione avviene solo sul frammento neo-sinte4zzato. Sistema di riparazione del DNA Da che cosa sono causate le mutazioni? Un certo numero di errori durante la replicazione del DNA avviene spontaneamente. Il tasso di mutazione può e s s e r e Agenti fisici (ad es raggi X o UV) enormemente Agenti mutageni chimici a u m e n t a t o dall esposizione ad agenti mutageni I mutageni chimici sono molecole che si combinano con il DNA oppure causano cambiamenti chimici nelle basi nucleotidiche oppure sono simili alle basi nucleotidiche e vengono incorporate al loro posto causando però errori di appaiamento 1

2 23/11/17 Mutazioni silenti. Mutazioni geniche: Sos4tuzione La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene). In base alle conseguenze se ne distinguono tre mutazioni SILENTI tipi Se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene una tripletta che specifica per lo stesso aminoacido proteinadiverse prodotta sarà la Fino a laquattro triplette stessaspecificano lo stesso aminoacido (il codice genetico è degenerato) mutazioni DI SENSO mutazioni NON SENSO Le sostituzioni silenti spesso riguardano la terza base del codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano lo stesso aminoacido Mutazioni DI SENSO. Nella maggior parte dei casi la nuova tripletta codifica per un diverso aminoacido C C G C U PU roli Alani La proteina avrà quindi nalo stesso numero di aminoacidi na ma una sequenza che differisce per un aminoacido La gravità degli effetti di una sostituzione dipenderà dalla somiglianza tra l aminoacido sostituito e il nuovo e dalla si compara la sequenza dell emoglobina uomo con altre specie si osservano posizione delladell sostituzione Se differenze in parecchi aminoacidi e pur tuttavia tutte queste emoglobine svolgono la funzione in modo efficiente. Alcune regioni della proteina sono molto simili anche tra specie filogeneticamente lontane, si dice che questa è una regione ben conservata. Mutazioni NON SENSO. Se il nuovo codone che si forma dalla sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più corta della precedente (dipende dal punto in cui è avvenuta la sostituzione) AAG Lisina TAG Codone di stop Le mutazioni di senso rappresentano la principale variazione gene4ca su cui lavora la Selezione Naturale Mutazioni nella strurura dei Mutazioni geniche: Delezione o Inserzione Talvolta l errore consiste nell inserire una base in più nella sequenza del DNA. Altre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA si ha la perdita di una base In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene completamente alterata Esistono 4 tipi cromosomi principali di mutazione della struttura dei 2. cromosomi: 1. delezione duplicazione 3. inversione 4. traslocazione (mutazioni per spostamento della griglia di lettura - frame shift) A (inserzione) A U G A G G A C U C C C G G A U U A Met Gly Arg Leu Thr Pro A U G A G G A A C U C C G A U U A Asp Iso Ser C G Arg 2

3 Mutazioni ed Evoluzione SNP (single-nucleo2de polymorphism; in gergo snip ). Ques2 polimorfismi sono pun2 del genoma dove la sequenza differisce da una persona all altra della stessa popolazione 0,1% circa 3x10 6 nucleo2di Mutazione del gene MYH16 (myosin heavy chain 16) ha permesso lo sviluppo del cranio in homo sapiens rispetto ad altri primati, Questo guadagno evolutivo è stato ottenuto sacrificando i potenti muscoli della mascella. ESPRESSIONE GENICA: FLUSSO DI INFORMAZIONI DAL DNA ALLE PROTEINE CELLULA EUCARIOTICA Ogni step cos4tuisce un possibile punto per controllare l abbondanza di una certa proteina. La maggior parte del controllo avviene a livello della TRASCRIZIONE. ESPRESSIONE GENICA: FLUSSO DI INFORMAZIONI DAL DNA ALLE PROTEINE CELLULA EUCARIOTICA -PROCARIOTICA Regolazione Genica nei procarioti E. coli ha 4288 geni codificanti. Geni costitutivi: costantemente trascritti (es. geni che codificano per proteine della glicolisi). Geni inducibili: espressi solo in determinate condizioni (es. geni che codificano per proteine del metabolismo del lattosio vengono espressi solo in presenza di questo zucchero nell ambiente). Regolazione dell attività di un enzima e/o regolazione del numero di molecole di enzima per cellula. 3

4 Regolazione Genica nei procarioti Jacob e Monod (1961): identificano l Operon Lac, complesso genico comprendente Ø geni strutturali con funzioni correlate (lacz, lacy, laca codificanti per galattosidasi, galattosio permeasi, galattoside transacetilasi) sotto il controllo di un unico promotore Ø geni di controllo (operatore e repressore) Regolazione Genica nei procarioti L operatore è una sequenza di basi, in parte sovrapposta al promotore, che si trova a monte del primo gene strutturale In assenza di Lattosio, una proteina repressore (codificata da un gene regolatore costitutivamente espresso) si lega all operatore lattosio, l RNA polimerasi non può legarsi al promotore e la trascrizione dell operone Lac è inibita Regolazione Genica nei procarioti Il repressore lattosio ha anche un sito di legame allosterico per l allolattosio (prodotto in piccole quantità in presenza di lattosio). Quando l allolattosio lega il repressore, questo si modifica e si stacca dall operatore, il promotore si libera e l RNA può trascrivere l operone In assenza di allolattosio, il repressore si lega nuovamente all operatore, bloccando la trascrizione dell operone Regolazione dell espressione genica nei procario4 Principalmente regolazione trascrizionale Un esempio è l OPERONE LAC: geni, trascrie insieme, che codificano per 3 proteine necessarie per l u4lizzo del larosio (galarosio-glucosio). Questo operone viene trascriro se c è il larosio e non c è il glucosio. IL REGULONE Regulone: gruppo di operoni controlla4 da un solo gene regolatore La proteina CAP controlla la trascrizione di una serie di operoni coinvol4 in diverse vie cataboliche Una mutazione di CAP può impedire alla cellula di metabolizzare una serie di zuccheri da essa regola4 4

5 OPERONE LAC Questa ESPRESSIONE può avvenire con una efficienza diversa. 22/11/17 Trascrizione 28 Regolazione dell espressione genica negli eucario4 Eucarioti pluricellulari: -un singolo organismo, utilizzando un unico genoma, deve produrre centinaia di tipi cellulari differenti e specializzati; -le cellule differenziate sono prodotte da popolazioni di cellule immature, non specializzate, dette cellule staminali, attraverso un processo noto come differenziamento cellulare Cellula umana contiene circa geni Geni per proteine RNA genes Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale ( 5000 geni) Geni housekeeping metabolismo biosintesi membrana istoni ribosomali Geni tessuto - specifici DIFFERENZIAMENTO CELLULARE A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA 5

6 I meccanismi di controllo usati per regolare l espressione dei geni umani devono essere molto più complessi di quelli utilizzati dagli altri organismi. Regolazione dell espressione genica negli eucario4 Controllo dell espressione genica: 1. Controllo trascrizionale: a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina b) FATTORI TRASCRIZIONALI: legame di farori proteici a sequenze nucleo4diche di regolazione (AEvatori e repressori) a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina 22/11/17 Trascrizione 33 22/11/17 34 EPIGENETICA: Acetilazione e altre modifiche istoniche e metilazione del DNA. Si tratta di modifiche della cromatina che non comportano cambiamenti nella sequenza di basi del DNA. Acetilazione degli istoni e altre modifiche istoniche e metilazione del DNA modificano la struttura della cromatina e possono REGOLARE L ESPRESSIONE DEI GENI MEDIANTE: MECCANISMI EPIGENETICI GENE: Ogni regione del DNA capace di sintetizzare una molecola funzionale di RNA. Regolazione dell espressione genica negli eucario4 Controllo dell espressione genica: 1. Controllo trascrizionale: a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina b) FATTORI TRASCRIZIONALI: legame di farori proteici a sequenze nucleo4diche di regolazione (AEvatori e repressori) 6

7 b. FATTORI TRASCRIZIONALI PROTEINE CHE RICONOSCONO E LEGANO SPECIFICHE SEQUENZE ALL INTERNO DI UN PROMOTORE: Una serie di fattori di trascrizione deve legarsi al promotore prima che la RNA polimerasi vi si possa legare e trascrivere quindi, a livello basale, il gene. L efficienza della trascrizione dipende anche dal legame di proteine di regolazione, attivatrici e, in alcuni casi di repressione, al promotore. Altre sequenze di DNA, spesso molto distanti dal promotore, sono ulteriormente implicate nella regolazione, aumentandola (enhancer) o reprimendola (silencer). - FATTORI TRASCRIZIONALI BASALI sono indispensabili per l inizio della trascrizione, aiutano la RNA polimerasi a riconoscere il promotore - ATTIVATORI TRASCRIZIONALI aumentano l efficienza di trascrizione - REPRESSONI TRASCRIZIONALI diminuiscono l efficienza di trascrizione Elementi distali -100 GC box -80 CAAT box -25 TATA box Elementi prossimali Promotore basale 22/11/17 FaRori trascrizionali 37 22/11/17 FaRori trascrizionali 38 ENHANCER - SILENCER Una sequenza enhancer classica contiene al suo interno parecchi elementi di controllo differenti, ognuno dei quali è costituito da una corta sequenza di DNA che funziona da sito di legame per uno specifico fattore di trascrizione regolativo (attivatore). Spesso i siti di legame possono essere gli stessi presenti nelle sequenze prossimali. I silencer sono meno abbondanti, legano fattori in grado di ridurre l efficienza di trascrizione (repressori). REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE: FATTORI TRSCRIZIONALI LA REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE AVVIENE ATTRAVERSO IL LEGAME DI FATTORI PROTEICI (FATTORI DI TRASCRIZIONE) A SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI REGOLAZIONE. I FATTORI PROTEICI IMPEGNATI A REGOLARE L ESPRESSIONE GENICA AGISCONO IN TRANS LEGANDOSI ALLE SEQUENZE DI DNA CHE SONO IN PROSSIMITA DEL GENE (IN CIS) 22/11/17 FaRori trascrizionali 39 22/11/17 FaRori trascrizionali 40 FATTORI TRASCRIZIONALI 7

8 Regolazione trascrizionale in risposta ad ormoni lipofili# In assenza di stimolo il recettore è inattivato mediante il legame con una proteina di inibizione (HSP90) 22/11/17 FaRori trascrizionali 43 I DUE PRINCIPALI MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE (MECCANISMI EPIGENETICI E FATTORI TRASCRIZIONALI) SPESSO AGISCONO INSIEME. Repressori e attivatori, grazie a co-attivatori/corepressori, dirigono quindi la deacetilazione/ acetilazione degli istoni a livello di specifici geni 22/11/17 FaRori trascrizionali 45 22/11/17 FaRori trascrizionali 46 STRUTTURA GENE EUCARIOTICO Regolazione dell espressione genica negli eucario4 Controllo dell espressione genica: 2. Controllo post-trascrizionale: SPLICING ALTERNATIVO STABILITÀ DELL mrna (mirna, sirna) 8

9 Regolazione dell espressione genica negli eucario4 Splicing alternativo La stabilità dell mrna citoplasmatico è variabile! 9

10 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 was awarded jointly to Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" hrp:// The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 was awarded jointly to Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by doublestranded RNA" hrp:// pri-mirna pre-mirna mirna 10

11 1.Complementarità imperfetta I mirna bloccano l espressione dei loro geni target a livello traduzionale Per inibire la traduzione legano solitamente le regioni non tradotte al 3 (3 UTR),per le quali presentano omologia 2.Complementarità perfetta I mirna che legano i loro RNA bersaglio con complementarietà perfetta inducono il taglio del bersaglio che,quindi,non può più essere tradotto: STABILITA DELL mrna Target, attivano la degradazione dell mrna In questo caso i mirna trovano la loro regione di omologia o nell ORF(open reading frame) o nella sequenza codificante sirna I sirna agiscono principalmente determinando la degradazione dello specifico mrna bersaglio attraverso un meccanismo definito RNA interference(rnai) Molecole di sirna si producono a partire da RNA normalmente estranei alla cellula, quali trasposoni,virus o transgeni. RNAi perciò rappresenta un sistema di difesa contro l invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma STRUTTURA GENE EUCARIOTICO Modello per la biogenesi e l attività di mirna e sirna 11

12 MiRNAs filogene4camente conserva4 sirna agiscono solo per complementarietà perfetta per cui ogni sirna può avere un unico mrna bersaglio e modulare la stabilità dell mrna Diversamente, i mirna costituiscono una numerosa classe di geni endogeni filogeneticamente conservati,la cui funzione è di inibire l espressione genica principalmente attraverso l inibizione della traduzione Ogni mirna,per il suo caratteristico meccanismo d azione può avere più di un mrna bersaglio MiRNA CIRCOLANTI MiRNA CIRCOLANTI MiRNA CIRCOLANTI 12

13 mirna CIRCOLANTI MiRNA CIRCOLANTI: marcatori diagnostici AML: acute myeloid leukemia DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma 13