Le molecole di RNA possono assumere particolari strutture che conferiscono loro particolari funzioni.

Transcript

1 Traduzione: t-rna

2 Le molecole di RNA possono assumere particolari strutture che conferiscono loro particolari funzioni. Singola catena alta flessibilità ripiegamento su stessa legami deboli con se stessa complementarietà locale forma sequenzadipendente forma = riconoscimento specifico catalizzatore di reazioni chimiche ruolo cetrale nei primi passi evolutivi

3 ulteriori legami H che si formano nel ripiegamento 3D dihydrouridine pseudouridine

4 IUPAC nucleotid code A C G T (or U) R Y S W K M B D H V N Base Adenine Cytosine Guanine Thymine (or Uracil) A or G C or T G or C A or T G or T A or C. or - gap C or G or T A or G or T A or C or T A or C or G any base

5 Gli appaiamenti tra basi costanti sono 20, per un totale di 52 legami H 12 CG = 36 legami H; 8 UA = 16 legami H Ci sono poi circa 40 ulteriori legami H

6 RNA Transfer Molecola di trna specifica per l amino acido triptofano. Il trna ha attaccato da una parte il triptofano e dall altra l anticodone ACC complementare al codone UGG sull mrna

7

8 C C A basi conservate appaiamenti struttura terziaria conservata elevato impaccamento la maggior parte delle basi inaccessibili al solvente fanno eccezione il terminale CCA accettore l anticodone (mrna)

9 Caratteristiche comuni a tutti i trna 1. Singole catene di basi 2. Elevata percentuale di basi insolite (7 15) Es: Metilazioni aumentata idrofobicità 3. Terminale 5 fosforilato ( in genere pg) 4. Tripletta terminale 3 CCA (legame con l AA) 5. ~ metàdeinucleotidiappaiati 6. Ansa dell anticodone composta di 7 basi con la seguente regolarità: Pirimidina Pirimidina- x y z -Purina--Base variabile (C o U) (C o U) anticodone (A o G)

10 Guanosina Uridina Uridina Adenosina

11 Traduzione: ribosomi l mrna esce dal nucleo

12

13 coefficiente di sedimentazione, v t : velocità di sedimentazione, a: accelerazione applicata (es. gravità) 1S = 1 Svedberg = sec

14

15

16 Sono mostrati solo tre dei molti fattori di inizio richiesti: elf2, elf4g, elf4e L interazione tra la coda poli-a e elf4g serve ad accertarsi che entrambe lee estremità dell RNA siano intatte E anche richiesta la coda di poli-a legata alla relativa proteina Figure 6-72 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

17 Figure 6-66 (part 1 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

18 Figure 6-66 (part 2 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

19 Figure 6-66 (part 3 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

20 Figure 6-66 (part 4 of 4) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

21

22 Figure 6-56 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

23 C C A Adenina, A Figure 6-57 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

24 Figure 6-58 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

25 Figure 6-67 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

26 Figure 6-67 (part 2 of 7) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) elongation factor

27 Figure 6-67 (part 4 of 7) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

28 Figure 6-74 (part 1 of 3) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

29 Figure 6-74 (part 2 of 3) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

30 Figure 6-74 (part 3 of 3) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

31 AA + AMP = AA adenilato L energia da idrolisi di un ATP viene utilizzata per promuovere il legame AA-tRNA legame AA-tRNA e distacco di AMP

32

33

34 Tecniche per il sequenziamento degli acidi nucleici

35 Nel 1965 viene determinata la prima sequenza completa di un Acido Nucleico: il trna dell alanina di lievito (78 nucleotidi) 1971: prima mappa di restrizione (individuazione della disposizione dei geni sul genoma mediante enzimi di restrizione) del DNA circolare di SV40 (11 frammenti di restrizione). Nel 1975 viene sequenziato il primo genoma completo: l RNA del fago MS2 (3568 nucleotidi). 3 geni separati da pochi nucleotidi Alle estremità 2 lunghe (129 e 174 basi) regioni non tradotte

36 Il Progetto Genoma (inizio fine 2003) Department of Energy and the National Institutes of Health Scopi del Progetto determinare le sequenze delle circa 3x10 9 coppie di basi di cui é costituito il DNA umano identificare tutti i circa ~10 5 geni geni del DNA umano registrare tutta l informazione in Banche Dati sviluppare strumenti per l'analisi dei dati raccolti trasferire le tecnologie sviluppate ai settori privati indirizzare le questioni etiche, sociali e legali che originino dallo svolgimento del progetto

37 Operazioni preliminari al sequenziamento Molecola troppo grande taglio in punti definiti DNasi completamente aspecifiche impossibile tagliare in punti specifici RNasi specificità strutturale Enzimi di restrizione

38 La scoperta degli enzimi di restrizione DNA E.coli di ceppo B in E.coli di ceppo C digestione 1966: si osserva la sopravvivenza di un DNA virale in E.coli enzima di modificazione basi metilate enzima di restrizione

39 sono stati identificati più di 150 siti di restrizione specifici sequenze specifiche di 4-8 basi casuale 1/256 1/ GTPy PuAC 3 3 CAPu PyTG 5 I frammenti di DNA tagliati dagli REs (restriction enzymes) possono essere separati, in base alle loro dimensioni relative, utilizzando l lettroforesi su gel di agaroso

40 1. enzima di restrizione EcoRI 2. frammenti DNA con estremità coesive 3. fusione con DNA ligasi 4. clonazione tramite plasmidi

41

42 taglio al centro del sito di riconoscimento frammenti ad estremità piatte taglio sfalsato frammenti ad estremità coesive CCGC GG GG CGCC CCGC CGCC DNA ricombinante

43 moltiplicazione genica clonaggio molecolare DNA ricombinante utilizzando plasmidi e fagi come vettori Molti batteri contengono uno o piú plasmidi v Molecole di DNA circolare a doppia-elica v # coppie di basi (bp): da 3000 a v unitá autonoma di replicazione v opzionale per la cellula ospite (resistenza agli antibiotici)

44 I plasmidi sono utilizzati come vettori di clonaggio un frammento di DNA, proveniente da altra sorgente, é integrato nel plasmide (plasmide chimera) plasmide modificato é inserito in una cellula di E.coli le cellule con il plasmide chimera sono individuate dalla loro resistenza ad un farmaco l insieme dei discendenti di queste cellule é un clone I plasmidi sono utilizzati come vettori d espressione esprimendo il gene inserito si può produrre una proteina di interesse medico (es: insulina)

45 Costruzione e clonazione di molecole di DNA ricombinante I passi sono: Costruzione di una molecola ricombinante (plasmide) Introduzione nelle cellule ospite (batteri mutanti che non degradino rapidamente il DNA estraneo) Selezione e clonazione delle cellule che portano il DNA ricombinante