I CANALI IONICI: PARTE PRIMA

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1 I CANALI IONICI: PARTE PRIMA I canali ionici costituiscono una classe di proteine, presente in tutte le cellule, che consentono il passaggio degli ioni attraverso la MP: questi si muovono per differenza di concentrazione e differenza di potenziale. I flussi attraverso i canali ionici costituiscono un segnale che modula l attività cellulare, costituendo una rilevante parte dei meccanismi di cell signaling. CARATTERISTICHE GENERALI DEI CANALI IONICI La proteina-canale (sinteticamente, il canale) è una proteina integrale, multimerica, che delimita internamente un canale acquoso. Il canale può assumere una conformazione che consente il passaggio dello ione (stato aperto) o una conformazione che non consente il passaggio dello ione (stato chiuso) (Fig. 5.1, A). In molti casi può assumere una terza conformazione, lo stato inattivato, che non consente il passaggio dello ione e non consente il passaggio allo stato aperto. Lo stato inattivato origina da una prolungata applicazione dello stimolo (prolungato è un termine relativo; una frazione di ms è sufficiente per inattivare i canali al Na + voltaggio-dipendenti). Se lo stimolo viene rimosso, dallo stato inattivato il canale passa nello stato chiuso (Fig. 5.1, B); è questo l unico modo di uscire dallo stato inattivato. A Ioni Poro del canale ionico B Stimolo prolungato Canale ionico aperto Canale ionico inattivato Rimozione dello stimolo Stimolo Rimozione dello stimolo Canale ionico aperto Doppio strato lipidico Canale ionico chiuso Canale ionico chiuso Fig A, sono mostrate due conformazioni (o stati) della proteina-canale: lo stato aperto e lo stato chiuso, sempre presenti. L'apertura extracellulare del canale è detta poro. B, è mostrato anche lo stato inattivato. Un generico stimolo porta il canale nello stato aperto ed inattivato. Dallo stato inattivato si può andare solo nello stato chiuso, previa rimozione dello stimolo (modificata da Il canale ha una certa probabilità P di essere in uno di questi 3 stati. Lo stimolo (un ligando, per esempio) aumenta la P di trovarsi nello stato aperto (questo aspetto verrà trattato successivamente). I canali sono denominati in funzione dello stimolo che aumenta la probabilità di essere nello stato aperto: i canali ligando-dipendenti sono canali la cui apertura è favorita (sono attivati) dall interazione con un ligando (l acido glutammico, per esempio), i canali meccano-dipendenti sono attivati da uno stimolo meccanico (la deformazione della proteina-canale), i canali termodipendenti sono attivati dalla temperatura, i canali voltaggio-dipendenti sono sensibili alla differenza di potenziale transmembranale (il potenziale di membrana Vm).

2 I canali ionici possono essere molto selettivi (passa solamente il Ca 2+, o il Na +, o il K +, o il Cl - ), o poco selettivi (passa il Na + ed il K +, passa il Na +, il K + e il Ca 2+ ); attraverso lo stesso canale non possono però passare ioni positivi e negativi (mai possono passare, per esempio, il Cl - ed il Na + ). Un canale viene così denominato anche in funzione dello ione che può passare: un canale al Ca 2+ voltaggio-dipendente è un canale che consente il passaggio del Ca 2+ ed è sensibile a Vm. Gran parte delle funzioni del sistema nervoso originano dall'attività di canali ionici; il rene utilizza i canali ionici per riassorbire gli ioni; i canali al Ca 2+ controllano l'ingresso nella cellula di questo ione, un messaggero intracellulare universale coinvolto in una miriade di processi (esocitosi, contrazione muscolare, migrazione e proliferazione cellulare); di fatto, come vedremo, l'ingresso di Ca 2+ è modulato anche dall attività degli altri canali ionici, che partecipano dunque ai meccanismi di controllo della concentrazione intracellulare di Ca 2+ [Ca 2+ ] i. Esamineremo ora 3 tipi di canali voltaggio-dipendenti, 1) il classico canale al Na + voltaggio-dipendente (Na + (V)) a rapida inattivazione o fast; esiste un altro tipo di canale al Na+ voltaggio-dipendente, a lenta inattivazione; 2) il canale al K + voltaggio-dipendente delayed (K + (V) delayed) 3) il canale al K + inward rectifier. 4) I canali al Ca 2+ -voltaggio-dipendenti Il canale al Na + voltaggio-dipendente I classici canali al Na + (V) fast sono canali permeabili al Na + che possono assumere, in funzione di Vm, 3 conformazioni (canale aperto, chiuso, inattivato; Fig. 5.1,B). La probabilità di essere nello stato chiuso (Pc) è molto alta, praticamente 1, per Vm=-100 mv ed il canale è stabilmente nello stato chiuso; depolarizzando la cellula a 0 mv, tutti i canali che erano nello stato chiuso vanno nello stato aperto nel giro di una frazione di ms: la probabilità di essere nello stato aperto (Pa) è praticamente 1; tuttavia, dopo circa 0.5 ms di pepolarizzazione stimolo i canali che erano nello stato aperto passano tutti nello stato inattivato (Pi=1). Per uscire dallo stato inattivato la cellula deve ripolarizzarsi (deve essere rimosso lo stimolo); ritornando a 100 mv tutti i canali passano dallo stato inattivato a quello chiuso in circa 5-7ms. Per Vm intermedi tra 100 e 0 mv la situazione è complessa (il concetto di canale aperto o chiuso è leggermente più complesso e viene meglio spiegato successivamente). Possiamo però dire che 1) La probabiltà di apertura Pa è proporzionale all entità della depolarizzazionese, se ho 100 canali al Na + (V), passando rapidamente da -100 mv a 0 mv, Pa= 1 e si apriranno tutti i 100 canali presenti (Fig. 5.2). Fig Probabilità di apertura depolarizzando la cellula a partire da -100 mv.

3 2) se passo da 100 a -60 mv una frazione di canali passa nello stato aperto (circa il 25%) (fig. 5.2). 3) se resto a -60 mv i canali che erano nello stato aperto vanno nello stato inattivato; a -60 mv avrò quindi il 75% dei canali nello stato chiuso ed il 25% nello stato inattivato; se ho un Vm di -60 mv e vado a 0 mv, si aprono tutti i canali chiusi, cioè il 75% di tutti i canali presenti. Qualitativamente, andando a 0 mv si aprono tutti i canali chiusi. Se alcuni canali sono nello stato inattivato, questi non si aprono. Se vado a 0 mv partendo da -90 mv o vado a 0 mv partendo da - 60 mv, si aprono meno canali partendo da -60 mv(circa il 25% di canali non si apre, restando nello stato inattivato). Torneremo sul concetto di probabilità di essere nello stato aperto, chiuso, inattivato dopo aver esaminato il comportamento del singolo canale studiato tramite il patch clamp. Il canale al K + voltaggio-dipendente delayed I canali al K + (V) delayed (delayed significa "in ritardo") sono canali permeabili al K + la cui conformazione è anch essa funzione di Vm. Per Vm=-100 mv la Pc di essere nello stato chiuso è molto alta ed il canale passa gran parte del tempo nello stato chiuso; per Vm= 0 la probabilità di essere nello stato aperto Pa è molto alta, ed il canale passa gran parte del tempo nello stato aperto. I canali al K + (V) delayed non hanno uno stato inattivato. Per Vm intermedi tra 100 e 0 mv Pc e Pa assumono valori intermedi tra i rispettivi minimi e massimi. Torneremo sul concetto di probabilità di essere nello stato aperto, chiuso, inattivato dopo aver esaminato il comportamento del singolo canale studiato tramite il patch clamp. I canali al Ca 2+ voltaggio-dipendenti I canali al Ca 2+ voltaggio-dipendenti sono canali permeabili al solo Ca 2+, attivati dalla depolarizzazione. Il potenziale di equilibrio del Ca 2+ è tale che questo tende sempre ad entrare, per cui i canali al Ca 2+ voltaggio-dipendenti aumentano la concentrazione citosolica di tale ione. Tali canali costituiscono un ampia e variegata famiglia di canali, caratterizzabile principalmente da due parametri, la soglia di attivazione e la velocità di inattivazione. 1) La soglia di attivazione Per quanto riguarda la soglia di attivazione, i canali al Ca 2+ voltaggio-dipendenti si possono dividere in due categorie, a) canali HVA (high voltage activated), attivati depolarizzando Vm a circa -20 mv, b) canali LVA (low voltage activated), attivati depolarizzando Vm a circa -60 mv 2) La velocità di inattivazione La velocità di inattivazione è molto variabile nei canali al Ca 2+ voltaggio-dipendenti: i canali di tipo L nel cuore si inattivano in modo sensibile dopo circa 1 secondo, altri canali si inattivano nel giro di decine di millisecondi. La struttura generale dei canali ionici voltaggio- dipendenti Il canale ionico voltaggio-dipendente è una proteina multimerica che attraversa tutta la MP. Presenta una porzione interna che delimita un canale acquoso e che protrude nell'ambiente extracellulare con il poro. La porzione inserita nella MP presenta una distribuzione delle cariche asimmetrica, cosicchè la conformazione del canale è sensibile alle forze di Coulomb. Il dominio extracellulare può interagire con ligandi ed il dominio citosolico può interagire con ligandi od essere fosforilato, modificando così le proprietà funzionali del canale. La Fig. 5.3 mostra come il cambio di conformazione causato dalla variazione di Vm fa sì che due residui di isoleucina ed un residuo di acido glutammico chiudano il canale.

4 Aperto Chiuso 5.3. Nello stato chiuso due residui di Isoleucina ed uno di Glutammato sporgono nel canale impedendo il passaggio dello ione. Modificato da Free article Una zona del canale, detta filtro, determina la selettività del canale (Fig. 5.4). Filtro Fig Lo ione è circondato da molecole di H 2 O ( i pallini rossi) che rendono le dimensioni del complesso ione-h 2 O troppo grandi per attraversare il canale. Se questo è nella conformazione aperta il filtro (struttura in giallo) rimuove l'h 2 O e lo ione può attraversare il canale. Di fatto, lo ione è fortemente idratato (i pallini rossi rappresentano l'h 2 O) ed il complesso ioneacqua ha dimensioni tali che non può passare attraverso il filtro. La struttura del filtro è tale da consentire la de-idratazione selettiva degli ioni. Il Na + è più piccolo del K + ma lega più fortemente l'acqua rispetto al K + : un canale ionico selettivo per il K + è in grado di de-idratare il K + ma non il Na +, che così non può attraversare il filtro. I canali al Na + (V) classici e i canali al K + (V) delayed sono responsabili di un segnale cellulare denominato potenziale d'azione della fibra nervosa, utilizzato da cefalopodi, anfibi, uccelli e mammiferi.

5 IL POTENZIALE D'AZIONE DELLA FIBRA NERVOSA Lo sviluppo di organismi multicellulari di notevoli dimensioni ha "costretto" l'organismo a dotarsi di un sistema respiratorio, circolatorio ed escretorio che ovviassero all'inefficienza della diffusione nel consentire lo scambio di materiale con l'ambiente esterno. L'aumento del numero di cellule e delle dimensioni dell'organismo rende più complesso anche il sistema di controllo dell'organismo. Quando il Paramecio urta un ostacolo, si aprono dei canali al Ca 2+. Lo ione modula l'attività delle ciglia, facendogli invertire il movimento (a 2 min e 15 s). Il tutto avviene nell'ambito dei micron, grazie alla diffusione. Con l'aumentare del numero delle cellule la diffusione non è più utilizzabile e l'evoluzione ha sviluppato un sistema di controllo, il sistema nervoso, che assicura risposte agli stimoli estremamente rapide e complesse. Uno dei meccanismi che consente di reagire con rapidità è il potenziale d'azione della fibra nervosa, che consente una veloce trasmissione delle informazioni ed utilizza 2 tipi di canali ionici, i canali al Na + (V), ed i canali al K + (V) delayed. Il potenziale d'azione della fibra nervosa è una rapida inversione del potenziale di membrana, della durata di 1-2 ms (Fig. 5.5). Vm (mv) Na + in K + out I Na + (V) passano progressivamente dallo stato inattivato allo stato chiuso I canali al Na + (V) sono tutti nello stato inattivato. I canali K + (V) delayed passano progressivamente nello stato chiuso 0 2 (ms) Fig Potenziale d azione della fibra nervosa. La linea orizzontale rossa indica il periodo di tempo per il quale entra il Na + ; al termine della linea rossa i canali al Na + (V) entrano tutti nello stato inattivato (linea verde). La linea blù indica il periodo di tempo per il quale esce il K +. Durante la linea verde, tutti i canali al Na + (V) sono nello stato inattivato. La linea gialla (più corta del dovuto), in alto a destra, indica il passaggio dallo stato inattivato allo stato chiuso, che si completa in circa 7 ms. La linea rosa indica che i canali K + (V) delayed passano progressivamente nello stato chiuso. Uno stimolo depolarizzante la cellula, se supera una certa soglia (la depolarizazione deve essere di circa 15 mv), genera l'apertura rigenerativa dei canali al Na + (V): lo stimolo apre una frazione dei canali chiusi, entra il Na + che depolarizza ulteriormente la fibra, aprendo un'ulteriore frazione di canali. A 0 mv tutti i canali al Na + sono aperti ed il Na + continua ad entrare (il V E del Na + è circa 60 mv). I canali al Na + quindi si inattivano (ora Vm è circa 20 mv) e si aprono, in ritardo rispetto ai canali al Na + (ecco perchè si chiamano delayed), i canali al K + (V) delayed. Il K + esce (il V E del K + è circa -100 mv), la fibra si ripolarizza, causando la progressiva chiusura dei canali al K +. Inizia il progressivo passaggio dei canali al Na + dallo stato inattivo a quello chiuso. Questo passaggio avviene con una cinetica di tipo esponenziale, con una costante di tempo di circa 2 ms (Fig. 5.6).

6 Fig Avvenuta la ripolarizzazione, i canali al Na + passano dallo stato inattivo a quello chiuso con una cinetica di tipo esponenziale, avente una costante di tempo di 2 ms. Ciò vuol dire che, dopo un tempo pari a, il 63% dei canali inattivati passa nello stato chiuso. Nell'inserto è mostrata la cinetica di comparsa dei canali chiusi, che al tempo 0 erano tutti nello stato inattivato: dopo un tempo pari a il 63% dei canali è passato nello stato chiuso. Dopo un tempo pari a 3 ( 6 s) quasi tutti i canali inattivati sono passati nello stato chiuso. Al termine del PdA il citosol della fibra ha perso dei K + ed acquisito dei Na + : la Na + /K + ATPasi ristabilirà le corrette concentrazioni. Di fatto, un singolo PdA non modifica in modo rilevante la [Na + ] i e la [K + ] i, ma con l'aumentare del numero dei PdA le variazioni diventerebbero significative. Il PdA insorge fisiologicamente nel cono assonico della cellula (vedremo successivamente i meccanismi coinvolti) e si propaga velocemente, uguale a se stesso, lungo tutta la fibra (la velocità, a seconda della struttura della fibra, varia tra 1 m/s e 100 m/s) (Fig. 5.7). I canali al Na + (V) sono inattivati. Out In Fig Meccanismo di propagazione del potenziale d azione. La zona della fibra sede del potenziale d azione è depolarizzata sino a + 20 m e depolarizza le zone adiacenti oltre la soglia(le frecce indicano lo spostamento delle cariche ioniche). A destra insorge il potenziale d azione, ma non a sinistra, perché i canali al Na + sono inattivati.

7 Il meccanismo con cui si propaga il PdA è piuttosto semplice. Nel cono assonico insorge il primo PdA, cosicchè Vm arriva sino a circa 20 mv. Vi è quindi una differenza di potenziale con le zone vicine, nelle quali Vm è al valore basale (-90 mv). Cariche positive scorrono dalla zona sede del PdA alle zone vicine, e cariche negative scorrono dalle zone vicine alla zona sede del PdA. Le zone vicine vengono così depolarizzate oltre la soglia ed insorge un nuovo PdA, sia nel corpo cellulare che nella fibra nervosa. Il PdA della fibra nervosa depolarizza le zone vicine, ma il PdA non torna indietro, perché i canali al Na + (V) sono ancora inattivati (fig. 5.8). Il processo si ripete e il PdA percorrerà tutta la fibra, dal cono al inizio del terminale presinaptico (questo non ha canali al Na + (V) e K + (V) delayed ), sempre uguale: è questa la direzione ortodromica. Nelle fibre mieliniche il PdA insorge unicamente nei nodi di Ranvier, perchè i canali al Na + (V) e K + (V) delayed sono presenti solo in corrispondenza dei nodi (la conduzione è detta saltatoria). I meccanismi che determinano la velocità di propagazione della fibra nervosa non sono qui trattati: le fibre mieliniche sono le più veloci (saltatorio non si riferisce alla velocità di propagazione ma al fatto che il PdA insorge solo nei nodi di Ranvier). Nella conduzione saltatoria il Na + entra ed il K + esce solo nei nodi di Ranvier, con un risparmio metabolico rispetto alle fibre amieliniche. Dal meccanismo al finalismo : alcune domande. Perchè 1) l'evoluzione ci ha consegnato un canale al Na + con uno stato inattivato? 2) l'evoluzione ci ha consegnato un canale al K + delayed 3) il canale al K + delayed è privo di uno stato inattivato? 4) perchè il PdA dura così poco? Se durasse 10 ms, che cosa cambierebbe? 5) l'evoluzione ci ha consegnato i canali al Ca 2+ voltaggio-dipendenti

8 IL CANALE AL K + INWARD RECTIFIER Il canale al K + inward rectifier (rettificatore in ingresso) consente il passaggio del K + per Vm più polarizzati di circa -60 mv, mentre per Vm più depolarizzati il canale non è pervio (in effetti vi è una intera famiglia di canali inward rectifier, detti Kir). In Fig. 5.8 è riportata la relazione Corrente/Voltaggio per questo canale. Fig Relazione Corrente/Voltaggio per il canale Kir. A 100 mv, il V E del K +, il canale è aperto ma la corrente è nulla. Per Vm più depolarizzati di -60 mv il canale è chiuso e la corrente è nulla. Questo canale è voltaggio-dipendente in maniera opposta al canale K + (V) delayed (è aperto con la polarizzazione) ma, di fatto, la proteina-canale non è sensibile al voltaggio. Il canale è infatti sensibile al blocco da parte del Mg 2+ intracellulare. Se Vm è polarizzato oltre i -90 mv, il Mg 2+, ione positivo, non entra nel canale. Ma se Vm diviene meno polarizzato, la forza elettrostatica, che è diminuita, permette che il Mg 2+ entri nel canale. Per Vm da -90 a -70 mv il blocco è reversibile (lo ione ripetutamente blocca e sblocca il canale), per cui la corrente non è nulla. Per Vm da -60 in poi il blocco è permanente e la corrente nulla. Il canale è dunque aperto al potenziale di membrana basale della cellula e costituisce parte della permeabilità basale al K + responsabile di un Vm negativo, vicino al V E del K +. La famiglia Kir è molto numerosa ed è presente in moltissimi tipi di cellule, che possiedono una o più delle sue varianti. Un canale della famiglia Kir è inibito dall ATP intracellulare ed attivato dall ADP intracellulare e costituisce un sensore dello stato energetico della cellula (se ne parlerà successivamente). LA SOGLIA DEL POTENZIALE D'AZIONE Abbiamo sottolineato come sia necessaria una depolarizzazione di una certa intensità (di circa 15 mv) per evocare un PdA, un concetto che sembra contrastare con il carattere rigenerativo dell'apertura dei canali al Na + (vedi software Nerve Simulation). Per comprendere il perchè sia necessaria una depolarizzazione di una certa intensità per evocare un PdA è necessario considerare i flussi ionici presenti al Vm basale, che supponiamo essere -70 mv. A -70 mv sono aperti un certo numero di canali ionici al Na +, al K + ed al Cl -, che supponiamo, per semplicità, non voltaggio dipendenti. Considerando i rispettivi V E, avremo una corrente entrante basale INa +, una corrente uscente basale IK +. Il Cl - è in equilibrio (E Cl - = -70 mv) e, supponendo

9 che d una corrente entrante basale ICl - (escono cariche negative). Vm è stabile e la corrente somma delle 3 correnti (la corrente netta) è nulla. Una depolarizzazione apre una quota di canali al Na + (V), con una INa + (V) addizionale, che tende a depolarizzare ulteriormente la cellula. Ma cosa succede alle altre correnti? La depolarizzazione operata dallo stimolo diminuisce la corrente entrante basale INa +, aumenta la corrente uscente basale IK + ed il Cl -, non più in equilibrio, entra. Le variazioni di queste 3 correnti tendono tutte a ripolarizzare la cellula, opponendosi alla depolarizzazione dovuta all'apertura dei canali al Na + (V). Se il bilancio delle correnti è tale che la depolarizzazione dovuta a INa + (V ) è maggiore della ripolarizzazione dovuta alle variazioni delle correnti basali, il fenomeno diventa rigenerativo ed insorge il PdA. Alternativamente, Vm torna al valore basale. La refrattarietà Quando la fibra nervosa si ripolarizza la fibra nervosa è ineccitabile, perchè i canali al Na + (V) sono nello stato inattivo. La fibra è in uno stato di "refrattarietà assoluta". Successivamente una frazione sempre più grande di canali al Na + passa progressivamente nello stato chiuso e la fibra può essere nuovamente sede di un PdA. Durante il progressivo passaggio dei canali al Na + (V) dallo stato inattivo allo stato chiuso, la fibra deve però essere depolarizzata più intensamente affinchè l apertura dei canali al Na + (V) diventi rigenerativa (il perchè sia necessaria una depolarizzazione più intensa non viene discusso). Questo stato in cui la fibra è eccitabile ma è necessario uno stimolo di intensità maggiore (la soglia è aumentata) è detto refrattarietà relativa. Dopo circa 7 ms tutti i canali al Na + sono nello stato chiuso e la soglia è tornata normale.

10 Esercizi Considera una cellula con canali al Na + e K + non voltaggio-dipendenti Ricorda che I= G x driving force 1) Vm= - 80 mv, E K =-100 mv, E Na = 80 mv. Calcola il rapporto G K /G Na 2) Supponendo che Gk=100, calcola le correnti INa + e IK + per Vm= - 80 mv 3) Calcola le correnti INa + e IK +, utilizzando le G sopra calcolate, se porti Vm a - 60 mv