Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico

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1 Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Dottoressa Camerin Consuelo Laboratorio Oncoematologia Pediatrica

2 La PCR (Polymerase Chain Reaction), inventata e messa a punto da Kary Mullis nel 1983, è un metodo attraverso il quale una sequenza di DNA o cdna (RNA retrotrascritto) può essere amplificata esponenzialmente in vitro in modo specifico.

3 Per fare ciò è necessario: conoscere con precisione le estremità della sequenza da amplificare per poter sintetizzare i primers; utilizzare un enzima che non si denaturi alle alte temperature per poter fare cicli continui di PCR. L'enzima che si utilizza è denominato DNA Taq polimerasi ed è stato estratto da un batterio, Thermus Aquaticus, presente nei geyser del parco nazionale di Yellowstone

4 La PCR sfrutta i meccanismi cellulari di replicazione del DNA. I vari cicli di amplificazione procedono con andamento esponenziale e avvengono in un thermal cycler.

5 Il ciclo di PCR è composto da: denaturazione per uno o più minuti a C per separare il DNA nei suoi due filamenti; anealing per uno o più minuti a temperatura uguale o inferiore a 72 C per permettere l appaiamento dei primers al DNA; estensione per uno o più minuti a 72 C durante i quali la DNA polimerasi si lega al DNA in corrispondenza dei primers e sintetizza il filamento corrispondente a partire da ciascun primer.

6 Provette contenenti il DNA vengono riscaldate a C per un tempo che puo' variare da uno a pochi minuti, al fine di denaturare il DNA, cioe' di separarne la struttura a doppia elica nei suoi due filamenti.

7 La temperatura viene ridotta a C per uno o piu' minuti, per consentire l'adesione dei due inneschi alle rispettive sequenze complementari presenti sul DNA, a destra e a sinistra della regione che si desidera amplificare.

8 La temperatura e' portata a 72 C per uno o piu' minuti, per permettere a molecole di enzima Taq polimerasi di raggiungere le estremita' degli inneschi e di estendere questi ultimi copiando lo stampo di DNA.

9 Durante il secondo ciclo si formano molecole ibride con un filamento della lunghezza desiderata.

10 Nel terzo ciclo si ha la formazione delle prime molecole di DNA corrispondenti esattamente alla zona del genoma che si vuole amplificare.

11 Man mano che prosegue la sintesi aumenta la percentuale di molecole di DNA con le caratteristiche desiderate. Alla fine del quarto ciclo, otto molecole su sedici (cioe' 50% delle molecole presenti) corrispondono esattamente alla zona bersaglio.

12 Alla fine del quinto ciclo, ventidue molecole su trentadue (cioe' quasi 70% delle molecole presenti) corrispondono esattamente alla zona bersaglio.

13 Il grafico mostra la curva di sintesi di molecole di DNA. In blu sono indicate le molecole corrispondenti alla zona bersaglio, mentre in rosso sono indicate tutte le molecole sintetizzate, comprese quelle che contengono anche altre zone del genoma. Partendo da una sola molecola di DNA, alla fine di 30 cicli si puo' teoricamente ottenere oltre un miliardo (esattamente ) di molecole, di cui (cioe' praticamente 100%) corripondono alla zona che si desidera analizzare.

14 REAGENTI PER LA PCR Il campione può essere: - omogeneo (plasmide purificato), in questo caso poche molecole bastano a garantire l'amplificazione; - eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA come sospensione cellulari o materiale biologico), in questo caso devo usare molto DNA per avere un minimo sufficiente per garantire l'amplificazione. Di solito non si superano i 40 cicli, poichè dopo un certo numero di cicli l'amplificazione non è più esponenziale ma raggiunge un plateau dovuto a: - carenza di primers; - carenza di dntp. NUCLEOTIDI (dntp) Devono essere bilanciati, perchè se uno dei precursori è in concentrazione limitante, l'enzima incorpora qualcos'altro oppure si ferma.

15 MG ++ Non deve essere limitante: tutto ciò che metabolizza polimeri di nucleotidi necessita di Mg ++. Se è troppo in eccesso determina inaccuratezza, aumentando la frequenza degli appaiamenti dei primers con sequenza non omologhe. TEMPERATURA La Temperatura di anealing (Ta) deve essere più alta possibile. La Ta scelta deve impedire il verificarsi di self annealing: i due primers non devono appaiarsi fra loro, in particolare non si devono appaiare in corrispondenza del 3', perché è qui che comincia la polimerizzazione.

16 PRIMERS Sono prodotti sintetizzati chimicamente e perciò devono essere puri. 1) Unicità della sequenza oligonucleotidica; 2) Presenza di una o più G o C in 3 ; 3) Lunghezza intorno ai nucleotidi; 4) Temperatura di anealing (Ta) bilanciata tra i 2 primers. E' possibile utilizzare programmi al computer per verificare la specificità di legame del primer con la sequenza desiderata (es. Amplify, Primers, BLAST).

17 Si prende la sequenza completa del nostro gene In NUCLEOTIDE si inserisce il nome del gene che si vuole cercare.

18 Utilizzando i programmi di Primers e Amplify si fanno delle prove di PCR e si sceglie la coppia di primers che meglio soddisfa le nostre esigenze. Questa coppia di primers da un buon amplificato del nostro gene Questa coppia non va bene, perché si formano anche dimeri di primers oltre al nostro amplificato

19 Si cercano le eventuali omologie con altri geni. Alla fine si verifica in BLAST la specificità della propria sequenza.

20 Il prodotto di PCR così ottenuto va valutato per la sua lunghezza e specificità attraverso una corsa elettroforetica su gel di agarosio. La foto A mostra un prodotto di amplificazione con PCR di lunghezza 101bp (valutata attraverso il marcatore di peso molecolare noto), di buona quantità e specifico. A. N-myc 101 bp Marker GI -LI-N GI -CA -N Negative Foto da: Int J Oncol Feb;24(2):265-72, Pession A. et al.

21 La PCR appena descritta è definita qualitativa dato che non permette di risalire al numero di copie di DNA o cdna di partenza, visto che la reazione procede con andamento esponenziale e quantità di DNA di partenza anche molto diverse danno origine a prodotti di amplificazione simili al termine dei cicli. L amplificazione del DNA tramite PCR qualitativa, è un passaggio obbligato presente in pressoché tutte le tecniche di biologia molecolare.le più rilevanti riguardano la ricerca di mutazioni, il clonaggio, l analisi di marcatori genetici polimorfici, l identificazione di traslocazioni con significato prognostico; tutte queste metodiche sono ampiamente usate nel nostro laboratorio.

22 La PCR viene utilizzata nel clonaggio di geni di interesse. In questo caso uno dei due primer porta delle sequenze di riconoscimento per gli enzimi di restrizione. Il prodotto di PCR, dopo vari trattamenti, viene incorporato in un plasmide usato per essere amplificato in batteri. Alla fine di tutto ciò mediante il clonaggio siamo in grado di far replicare a dei batteri delle sequenze presenti nel DNA umano. C. Normale corsa di un amplificato di PCR B. cdna; M= Marker XIV; Controlli Positivi: a)pcr su batteri b)pcr su 1-14 = colonie clonate; no = controllo negativo.

23 La PCR può anche essere il punto di partenza per la metodica del sequenziamento automatico. In questo preciso caso si parte da una PCR che richiede solo un primer ed una mix con nucleotidi normali e nucleotidi fluorescenti. Quando questi ultimi vengono incorporati si interrompe la reazione di PCR, così si formano tanti frammenti di varia lunghezza con diversa fluorescenza. Ad ogni colore corrisponde una specifica base: in questo modo è possibile ricostruire, nucleotide per nucleotide, la sequenza analizzata. Questa metodica permette di vedere mutazioni puntiformi, breakpoint, sequenze complete del proprio frammento. breakpoint D.

24 La PCR viene usata per valutare la presenza di traslocazioni, con fattore prognostico, nel sangue di pazienti affetti da disordini mielodisplastici. Di seguito viene riportata una tabella con indicate le traslocazioni associate alle varie forme di LAM. Tipo di LAM Traslocazioni immunofenotipo Geni coinvolti Indifferenziata M0 Mieloblastica senza maturazione t(9;22)(q34;q11) CD13 +, 33 +, 34 + BRC, ABL M1 Mieloblastica con maturazione M2 Promielocitica M3 t(8;21)(q22;q22) t(3;21)(q26;q22) t(15;17)(q22;q11-12) t(11;17)(q23;q21) CD13 +, 33 +, 34 + CD13 +, 33 + ETO, AML1 EVI1, AML1 PML, RAR PLZF, RAR Mielomonocitica M4 t(1;11)(q21;q23) t(6;11)(q27;q23) t(9;11)(p22;q23) t(10;11)(p12;p23) t(11;19)(q23;p13.1) t(11;19)(q23;p13.3) inv(16)(p13;q22) t(16;16)(p13;q22) CD13 +, 14 +, 15 +, 33 + MLL Monoblastica M5a Monocitica M5b 11q23 (vedi M4) 11q23 (vedi M4) CD4 +, 13 +, 15 +, 33 +, 64 +, DR + MLL CD4 +, 13 +, 15 +, 33 +, 64 +, DR + MLL Eritroleucemia M6 Glicoforina A + Megacariocitica M7 t(1;22)(p13;q13) CD41 +, 61 +

25 Nelle foto E ed F si vedono due esempi di traslocazioni evidenziate mediante una PCR qualitativa. M Kasumi NO Pz M NB4 NO Pz t(8;21) 260 bp t(15;17) 289 bp E. Gel di paziente affetto da M2 F. con traslocazione t(8;21) Gel di paziente affetto da M3 con traslocazione t(15,17)

26 Mediante lo Spectratyping è possibile monitorare i cambiamenti che avvengono nelle popolazioni di linfociti successivamente al riconoscimento dell antigene, perchè si basa sull eterogeneità di dimensione a livello genico della regione CRD3 del recettore per l antigene dei linfociti T. Utilizzando una modificazione della PCR che prevede 25 primers per le regioni ipervariabili CDR3 della catena e un primer costante marcato (quindi fluorescente), è possibile valutare in dettaglio una popolazione di linfociti T, confrontando le lunghezze dei segmenti genici relativi a queste regioni. Gli amplificati sono analizzati con l aiuto di un sequenziatore a capillare che permette di rilevare la fluorescenza dei frammenti amplificati e ne determina le diverse lunghezze. G.

27 La PCR trova altre numerose applicazioni. Può venire impiegata nella diagnosi di malattie per individuare batteri o virus patogeni come l'hiv, il virus dell'epatite B, il mycobatterio tubercolare. Nel caso particolare della tubercolosi mediante la PCR si possono rilevare 10 bacilli su 10 6 cellule eucariotiche. Può venire impiegata nella diagnosi prenatale delle malattie ereditarie monogeniche come la distrofia muscolare, la fibrosi cistica, la talassemia. La PCR viene utilizzata anche nella valutazione della diversa capacità degli individui di metabolizzare i farmaci a partire dall'analisi dei polimorfismi dei geni che codificano per il complesso enzimatico del citocromo p450 coinvolto nelle reazioni metaboliche.

28 In ambito giuridico la PCR trova utilizzo nell amplificazione di tracce di DNA provenienti da campioni prelevati dalla scena del crimine come capelli, sangue o sperma. Il DNA amplificato può quindi essere analizzato e confrontato con quello della vittima e di un sospetto, i risultati usati per incriminare o scagionare il sospettato del crimine. La PCR trova impiego anche negli studi di evoluzione molecolare. E' possibile misurare l'omologia tra specie diverse confrontando le differenze esistenti fra nucleotidi dello stesso gene.