Biologia Molecolare: nuova frontiera del tecnico di laboratorio

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1 Relatore: Codecà Monia 11 dicembre 2008 Dip. di Medicina di Laboratorio direttore Dott.Claudio Dotti Biologia Molecolare: nuova frontiera del tecnico di laboratorio

2 Innanzitutto chi è il tecnico di laboratorio? Una piccola storia per conoscerci.. Mario è in montagna, accusa un malore, si reca al pronto soccorso, viene accolto dal personale medico e paramedico che presta le prime cure e procede agli accertamenti.. Dove vanno le provette di Mario? Chi se ne occupa? I tecnici di laboratorio biomedico, gli invisibili a Mario, provvedono all esecuzione dei test con competenza e professionalità, garantendo precisione ed accuratezza dei risultati. Reggio Emilia, 11 Dicembre

3 La figura del tecnico di laboratorio nasce nel contesto lavorativo degli anni 60. All inizio la professione richiedeva una grande manualità,e gli strumenti di lavoro erano: beute, provettoni, pipette, becchi Bunsen e sostanze chimiche di vario genere. Reggio Emilia, 11 Dicembre

4 Negli anni la medicina di laboratorio si è caratterizzata sempre più come settore ad alta specializzazione in rapido e continuo progresso. L aumento del numero e della tipologia di analisi richieste ha prodotto nei nostri laboratori lo sviluppo di ben 40 settori di lavoro distinti. Le nuove tecnologie e l informatizzazione migliorano qualità ed accuratezza del dato, diminuiscono i tempi di risposta, aumentano la sicurezza degli operatori, ma richiedono al TSLB conoscenze, abilità, e versatilità in situazioni sempre più complesse ed in continua evoluzione.

5 L ultima evoluzione del laboratorio riguarda i test di biologia molecolare L elevata sensibilità di questi test richiede al tecnico una grandissima attenzione e precisione. 5

6 BIOLOGIA MOLECOLARE È una branca della biologia che studia i meccanismi molecolari alla base della fisiologia cellulare, concentrandosi in particolare sulle interazioni tra le macromolecole, ovvero proteine e acidi nucleici (DNA e RNA). James Watson Francis Crick La nascita della biologia molecolare si può far risalire alla scoperta della struttura del DNA da parte di James Watson e Francis Crick nel 1953 quando presentarono ufficialmente il loro modello a doppia elica. Reggio Emilia, 11 Dicembre

7 I biologi molecolari studiarono come caratterizzare, isolare e manipolare le componenti molecolari delle cellule e degli organismi con lo scopo di capire i loro meccanismi di funzionamento più profondi. DNA = depositario dell informazione genetica DNA = fonte di tutte le attività degli esseri viventi Per biologia molecolare si intende una serie di tecniche che consentono la rilevazione, l'analisi, la manipolazione e l'amplificazione degli acidi nucleici. Reggio Emilia, 11 Dicembre

8 PCR: Reazione di Polimerizzazione a Catena Tecnica inventata nel 1983 dal Dott.Kary Mullis, che gli valse il premio Nobel per la Chimica nel 1993 Consente di amplificare in vitro segmenti di DNA specifici Kary Mullis È così sensibile da rilevare teoricamente anche una singola copia del DNA o RNA bersaglio ed ha un così alto grado di specificità che è entrata di diritto nella diagnostica di laboratorio Consente in poche ore di amplificare milioni di volte un segmento di DNA sfruttando i meccanismi cellulari di replicazione del DNA stesso Viene utilizzata per segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche di DNA come mutazioni, inserzioni virali e micro-organismi patogeni Reggio Emilia, 11 Dicembre

9 Animazione PCR DNA stampo 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo Crescita esponenziale del numero di copie ottenute con l aumentare del numero dei cicli di PCR

10 PCR: metodiche derivate RT-PCR: utilizzata per amplificare l RNA NESTED-PCR: aumenta la specificità dell analisi PCR QUANTITATIVA: consente la quantificazione degli acidi nucleici REAL-TIME PCR: tipo di PCR che permette un analisi in tempo reale Reggio Emilia, 11 Dicembre

11 FISH: Ibridizzazione Fluorescente In Situ Metodica potente e versatile che permette l individuazione e la localizzazione degli acidi nucleici direttamente sul materiale fissato (cellule, cromosomi in metafase o sezioni di tessuto) sfruttando particolari coloranti fluorescenti Permette sia la valutazione di anomalie cromosomiche (trisomie complete o a mosaico), che la precisa caratterizzazione di riarrangiamenti strutturali (traslocazioni, inversioni, delezioni, ecc). Immagine FISH Reggio Emilia, 11 Dicembre

12 Cromosoma marcato con tecnica FISH Reggio Emilia, 11 Dicembre

13 Eseguire un esame di biologia molecolare assume significati diversi che dipendono dalla finalità dell analisi stessa. Può significare: ricercare la presenza di DNA o RNA di varia natura; ricercare la presenza nel DNA o nell'rna di particolari sequenze di geni caratteristiche per ogni specifica patologia; ricercare la presenza nei geni dei riarrangiamenti strutturali quando ritenuti responsabili delle varie patologie. Tutti i laboratori del Dipartimento di Medicina di Laboratorio, del Dipartimento Oncoematologico e Malattie Infettive dell'arcispedale Santa Maria Nuova eseguono analisi di biologia molecolare. 13 Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008

14 L.A.C.C.E: settore COAGULAZIONE Esegue test ematici collegati al rischio di patologie cardiovascolari: la prima causa di mortalità nei Paesi Occidentali Fattori di rischio: ipercolesterolemia ipertensione diabete fumo obesità FAMILIARITA Il 50% dei soggetti che sviluppano patologie cardiovascolari presentano come unico fattore di rischio una forte storia di famigliarità indicando una predisposizione genetica allo sviluppo di tali patologie Vengono ricercate le mutazioni: del fattore V di Leiden della Protrombina (fattore II) della MTHFR (metilentetraidrofolatoreduttasi) con varie metodiche di PCR Queste mutazioni sono normalmente presenti nella popolazione sana ed esserne portatore non significa necessariamente sviluppare una patologia cardiovascolare. Reggio Emilia, 11 Dicembre

15 Grafici di rilevazione delle PCR del fattore V Campione negativo, assenza di mutazione Campione positivo presentante la mutazione in omozigosi Campione positivo presentante la mutazione in eterozigosi Reggio Emilia, 11 Dicembre

16 L.A.C.C.E: settore EMATOLOGIA Esegue test ematici su DNA e RNA per seguire l esordio, il monitoraggio, e la remissione di patologie leucemiche DNA: RNA: BCL1 Linfoma mantellare BCL2 Linfoma follicolare BCR/ABL Leucemia mieloide cronica PMR RAR α - Leucemia promielocitica AML1ETO Leucemia acuta mieloide Vengono utilizzate metodiche di PCR qualitativa che indicano la presenza o meno del clone cellulare cercato. Di più recente introduzione (2007) sono alcune metodiche di real-time PCR usate come esame prognostico per le leucemie mieloidi croniche sui geni BCR/ABL, JAK2 ewt1 Reggio Emilia, 11 Dicembre

17 Gel di amplificazione della Mutazione BCR-ABL Campione 1 POSITIVO per la mutazione Campione 2 NEGATIVO per la mutazione Negativo Marcatore di riferimento PCR-ABL PCR-P 190 PCR-P 120 PCR-ABL PCR-P 190 PCR-P 120 PCR-ABL PCR-P 190 PCR-P 120 Reggio Emilia, 11 Dicembre

18 L.A.C.C.E : settore EMATOLOGIA Esegue test ematici su DNA per confermare le diverse varianti emoglobiniche DNA: α Talassemia β Talassemia- β Talassemia Mediterranea BeTha Gene 2 / Asiatica Hb S-C Hb fetale Da alcuni anni a questa parte le emoglobinopatie sono aumentate molto, di numero e di variabilità, a causa dell'immigrazione extracomunitaria che ha portato sul territorio etnie con caratteristiche genetiche tipiche. Reggio Emilia, 11 Dicembre

19 LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA: settore BIOLOGIA MOLECOLARE Esegue test su diverse tipologie di materiali per rilevare la presenza di numerosi agenti infettanti quali virus, batteri e protozoi. VIRUS v. Erpetici Enterovirus Parvovirus Citomegalovirus HIV HCV HBV BATTERI Mycoplasma pneumonie Borrelia spp. PROTOZOI Chlamydia trachomatis Toxoplasma gondii Leishmania spp. Esempio di gel ottenuto dopo PCR. La presenza delle bande indica l avvenuta amplificazione. Le tecnologie utilizzate spaziano dalle metodiche manuali, applicate ai campioni con bassa cadenza analitica, fino a quelle di più recente messa a punto quali le real-time PCR usate ad esempio per la determinazione Reggio Emilia, 11 Dicembre 2008 quantitativa di HIV, HCV e HBV. 19

20 LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA: settore BK Esegue test su campioni di materiali respiratori per la rilevazione diretta del DNA del Complesso Mycobacterium Tuberculosis Circa un terzo della popolazione mondiale è infetta da Mycobacterium Tuberculosis ed è esposta ad un rischio del 10% di sviluppare la malattia nel corso dell esistenza. La lenta crescita di questo microrganismo (tempo di refertazione della coltura: 42 giorni) ritarda la diagnosi clinica e quindi il trattamento, contribuendo alla diffusione della malattia. Viene utilizzata una real-time PCR che consente un analisi rapida (esito in giornata) del campione, favorendo così un intervento medico tempestivo. Reggio Emilia, 11 Dicembre

21 LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA: settore BATTERIOLOGIA Esegue test real-time su campioni ematici per rilevare la presenza di batteri e funghi causa di sepsi: una delle principali cause di mortalità ospedaliera BATTERI Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Escherichia coli Klebsiella spp. Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa, ecc. FUNGHI Candida spp. Aspergillus fumigatus Esempio di grafico delle temperature di melting ottenuto durante la real-time PCR. La presenza dei picchi indica l avvenuta amplificazione. È stato condotto uno studio per determinare la performance del test su materiali biologici diversi dal sangue (liquor, liquidi biologici vari e pus da ascessi) confrontandone i risultati con quelli ottenuti mediante coltura standard. Considerando l importanza dei materiali analizzati e le conseguenze cliniche, i risultati ottenuti fanno concludere che il sistema usato trovi un utile impiego nel miglioramento della diagnostica microbiologica. Reggio Emilia, 11 Dicembre

22 SERVIZIO TRASFUSIONALE Esegue, per legge, test con tecniche NAT (tecniche di amplificazione degli acidi nucleici) per garantire la sicurezza degli emocomponenti che ottiene dalle donazioni Vengono analizzati : tutti gli aspiranti donatori, tutte le sacche prelevate, tutte le donazioni di sangue cordonale. ORGANIZZAZIONE DEL LAVORO Obbligo di legge per esami NAT: HCV dal 2002 HIV dal 2003 HBV dal 2006 POOLING ESTRAZIONE AMPLIFICAZIONE Reggio Emilia, 11 Dicembre

23 LABORATORIO DI GENETICA Esegue test con tecniche di PCR su persone che intraprendono il percorso della fecondazione assistita, per fare diagnosi di ritardo mentale e su donne affette dalla sindrome di Turner PERCORSO DELLA FECONDAZIONE ASSISTITA microdelezioni del cromosoma Y gametogenesi gene della fibrosi cistica individuare i portatori sani RITARDO MENTALE metilazione del cromosoma 15 sindrome di Prader-Willie sindrome di Angelman cromosoma X sindrome dell X fragile SINDROME DI TURNER segmenti del cromosoma Y aumento della probabilità di patologie tumorali Reggio Emilia, 11 Dicembre

24 LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA Esegue analisi con metodiche FISH per valutare le tipologie di alcune patologie oncologiche e nel caso di aborti spontanei. Carcinoma della mammella ricerca di amplificazioni del gene Her2-neu (cromosoma 17) Gliomi - ricerca di delezioni sul cromosoma1 e sul cromosoma 19 Linfomi ricerca di traslocazioni cromosomiche tipiche Aborti nel 1 trimestre di gravidanza - valutazione del cariotipo Reggio Emilia, 11 Dicembre

25 CARCINOMA DELLA MAMMELLA Campione negativo per l amplificazione del gene Her2-neu LINFOMI Campione positivo per l amplificazione del gene Her2-neu Linfoma follicolare Linfoma mantellare Reggio Emilia, 11 Dicembre

26 LABORATORIO DI ENDOCRINOLOGIA Abbina tecniche di RT-PCR e real-time PCR per uno studio sulla ricerca di cellule di carcinoma prostatico (CaP) circolanti nel sangue periferico. Il CaP è la neoplasia più frequentemente diagnosticata nel maschio adulto e la seconda causa di morte dopo il tumore al polmone. m-rna del PSA RT-PCR PCR Amplificato È l espressione della produzione cellulare di PSA c-dna del m-rna Se presente indica la presenza di cellule PSA secernenti nel campione (micrometastasi) Vengono ricercate le micrometastasi circolanti utilizzando il PSA (antigene prostatico specifico) come marcatore molecolare organo specifico, al fine di cercare di predire il decorso della patologia. Il ritrovamento di tali cellule nel sangue periferico può essere considerato un indice di progresso della malattia. Questa metodica è in grado di individuare correttamente i soggetti sani con una specificità del 100% in quanto non sono stati riscontrati falsi positivi però, gli elevati costi della metodica, ne fanno presupporre un utilizzo confinato a casi selezionati per il follow-up e non su larga scala. Lo studio è tutt ora in corso. Reggio Emilia, 11 Dicembre

27 IN DEFINITIVA. Il TSLB è responsabile dei campioni, ne valuta l idoneità ed esegue le procedure per la corretta conservazione e smaltimento. Attua e controlla le fasi del processo preanalitico e del processo analitico/produttivo, giudicando il funzionamento della strumentazione utilizzata, la validità dei reagenti e le modalità operative. Inoltre procede ad una valutuazione e validazione tecnica del dato. E abilitato all esercizio della professione dal corso di Laurea istituito nel 2001 o da titoli pregressi equipollenti, ma soprattutto attraverso corsi di aggiornamento teoricopratici riguardanti gli specifici campi di attività.

28 Conclusioni La biologia molecolare è un ulteriore dimostrazione della versatilità della professione del tecnico di laboratorio. Oggi il tecnico di laboratorio è un professionista con competenza teorica e manuale, chiamato a confrontarsi in modo autonomo con una realtà multidisciplinare ad ampio spettro. Inoltre il continuo divenire tecnologico richiede al TSLB dinamicità, adattabilità e necessità di mantenersi aggiornato per poter lavorare in modo competente e responsabile. ADATTABILITA DINAMICITA RESPONSABILITA MANUALITA COMPETENZA VERSATILITA Reggio Emilia, 11 Dicembre

29 Un sentito ringraziamento a tutti i colleghi che hanno contribuito alla realizzazione di questa presentazione.