Estrazione di RNA da Tessuti Cartilaginei utilizzando il Mulino Criogenico

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1 NOTA APPLICATIVA Estrazione di RNA da Tessuti Cartilaginei utilizzando il Mulino Criogenico Con la gentile concessione di ALTANA Pharma AG Lo scopo del presente studio è stata la determinazione di una possibile connessione tra le malattie artritiche, soprattutto a livello delle articolazioni delle ginocchia, e specifici geni. A questo proposito, è stato comparato il profilo di espressione di un certo numero di geni di donatori sani e malati. L RNA totale è stato isolato dai tessuti cartilaginei e l attività di specifici geni è stata analizzata tramite PCR o analisi di micro array. Tessuto Cartilagineo Umano Campioni di tessuti cartilaginei sono stati prelevati da diversi pazienti così come da donatori sani, congelati immediatamente in azoto liquido e conservati a -80 C. Uno o due grammi sono stati prelevati dai suddetti campioni per l estrazione di RNA e aggiunti ancora congelati nella camera del Mulino. Grazie all adattatore opzionale multi - provette, nel Mulino criogenico 6850 possono essere processati fino a quattro campioni. Utilizzando la funzione di precongelamento del 6850, i campioni sono stati mantenuti a circa -196 C per altri due minuti, il che ha assicurato un raffreddamento sufficiente e un grado di friabilità ottimale. Procedura di frantumazione/omogeneizzazione Per motivi tecnici - a causa della grande area di superficie e della piccola dimensione delle particelle, la polvere di cartilagine ha mostrato la tendenza a congelarsi rapidamente, cosa che dovrebbe essere assolutamente evitata (degradazione dell RNA) - il reagente di fenolo-cloroformio (peqgold RNAPureTM, peqlab; Erlangen, Germania) utilizzato per la successiva preparazione era già stato aggiunto ai campioni (circa 2, 2,5 ml). Dopo l aggiunta del reagente le provette di macinazione sono state posizionate in azoto liquido fino alla solidificazione del buffer. Successivamente, i campioni di cartilagine e il cilindro ad urto sono stati aggiunti alle provette raffreddate. Per assicurarsi che il cilindro non congelasse sul reagente, il Mulino Criogenico è stato avviato per poco al fine di controllarne il movimento ascoltando il suono emesso dallo stesso. La macinazione è stata eseguita in tre cicli di due minuti ciascuno alla massima frequenza. Nell intervallo tra i cicli di macinazione i campioni sono stati raffreddati per due minuti per raggiungere il grado ottimale di friabilità. L intera procedura è durata, quindi, 12 minuti. La polvere risultante è stata trasferita in provette Falcon e il reagente peqgold è stato aggiunto ulteriormente (circa 20 ml). Preparazione L RNA è stato successivamente purificato utilizzando il metodo di estrazione con fenolo-cloroformio, secondo le procedure di protocollo. Al fine di garantire un ottima purezza e qualità dell RNA, la fase liquida risultante è stata applicata al kit RNeasy midi. In seguito all esame fotometrico dell RNA, i campioni sono stati analizzati o con PCR quantitativa dopo trascrizione inversa o alternativamente con il sistema Affymetrix a GeneChip.

2 Le provette di macinazione sono state pulite in diversi passaggi. Innanzitutto, sono state pulite meccanicamente con carta e alcol al 70%, successivamente con del detergente e, dopo il risciacquo con acqua, sono state lavate ancora con alcol al 70%. Questo processo di pulizia dovrebbe essere effettuato prontamente in quanto il reagente a base di fenolo scongelandosi può danneggiare le provette (gli accessori in acciaio inox non sono sensibili). Prima di un uso successivo il set completo di macinazione è stato autoclavato. Le rese di RNA di cartilagine sono state tra 2 e 20 µg RNA a seconda del campione.

3 NOTA APPLICATIVA Modificazioni strutturali in polimeri con l uso del Mulino Criogenico Con la gentile concessione del Prof. Dr. U. Köster, Dip. di Ingegneria Chimica, Università di Dortmund Uno degli obiettivi nel campo delle Scienze dei Materiali è lo sviluppo di nuovi polimeri sintetici con proprietà che non possono essere ottenute tramite i processi di fusione standard dato che i polimeri tendono a separarsi durante il processo di riscaldamento. Il polimero puro I primi tentativi di introdurre modificazioni permanenti in polimeri utilizzando la macinazione meccanica criogenica (CMM) con il Mulino Criogenico sono stati effettuati con i seguenti due polimeri: Propilene isotattico (ipp) e Polistirolo sindiotattico (sps). In seguito alla fusione e alla ricristallizzazione, entrambi i polimeri macinati criogenicamente (ad esempio a -196 C) hanno evidenziato caratteristiche che differiscono da quelle dei polimeri di partenza. I test DCS (Calorimetria Differenziale a Scansione) hanno mostrato cambiamenti nelle temperature di cristallizzazione, che indicano una riduzione del peso molecolare o un cambiamento nella distribuzione del peso molecolare. Maggiore la durata della macinazione criogenica, maggiore il cambiamento. Ulteriori esperimenti hanno mostrato che la struttura cristallina viene progressivamente distrutta durante la frammentazione criogenica. Probabilmente la macinazione criogenica induce fissioni di catena e conseguentemente la formazione di macro radicali. Tutto ciò può portare a fenomeni di crosslinking e all incremento della componente amorfa nel polimero parzialmente cristallizzato. Un altra possibile spiegazione è la formazione di nano strutture, piccoli frammenti dei composti del polimero originale. Componenti Così come i risultati del polimero puro, anche i risultati riguardanti il comportamento dei componenti del polimero macinato a freddo sono molto interessanti. Quando si miscelano i due polimeri ipp e sps tramite fusione (estrusione) avviene la separazione. Tali miscele polimeriche sono dispersioni di un polimero all interno dell altro. Alcuni test di campioni macinati criogenicamente suggeriscono che nel co-polimero è avvenuta in parte una ri-combinazione di diversi macro radicali costitutivi. Questi copolimeri potrebbero agire come facilitatori di fase tra i componenti non miscibili dell ips e sps. Prova di ciò è la morfologia alterata delle miscele criogenicamente macinate. Anche le analisi di Calorimetria Differenziale a Scansione hanno evidenziato un diverso comportamento del cristallo. Inoltre dalle immagini a microscopio emerge che dopo la fusione e ricristallizzazione, il campione estruso presenta caratteristiche morfologiche di miscele di polimeri rimasti separati, mentre in un campione sottoposto a macinazione criogenica l ipp è finemente distribuito all interno dell sps. Conclusioni La macinazione criogenica con il Mulino Criogenico porta a cambiamenti nella struttura, nel comportamento termico e nella morfologia degli omopolimeri e dei composti polimerici. Mentre le differenze morfologiche raggiunte tramite fusione e ricristallizzazione sono parzialmente reversibili, i

4 cambiamenti strutturali sono permanenti. Oltre a fissioni di catena e i risultanti macro radicali, sono stati osservati fenomeni di cross linking e di ridotta cristallizzazione. Le miscele di polimeri prodotte tramite macinazione criogenica mostrano un considerevole aumento della dispersione di entrambi i polimeri l uno nell altro. Esattamente questo diverso grado di dispersione dà motivo di sperare nella produzione di nuovi materiali e forse anche con le caratteristiche desiderate.

5 NOTA APPLICATIVA Polimeri macinati per analisi quantitative e qualitative Con la gentile concessione dell Istituto Federale per la ricerca e l analisi dei Materiali (BAM) Nell applicazione di seguito esposta, il Mulino Criogenico 6850 è stato utilizzato per la macinazione di materiale sintetico compatto, come tessuti, e filati polimerici, filati di panni, filamenti (polipropilene, polietilene o poliestere). La frantumazione viene richiesta per effettuare accurate analisi qualitative e quantitative degli additivi contenuti in materiali sintetici, ad esempio antiossidanti usando HPLC e test INOC. Il mulino Criogenico si è rivelato ottimale per questa applicazione, garantendo la frantumazione del campione nelle dimensioni richieste in breve tempo. Esempio: tessuti in PP Il materiale viene dapprima frammentato in quadrati di circa 2 mm. Le provette di macinazione sono poi riempite fino a metà con il campione ed il programma di macinazione utilizzato è il seguente: Pre-raffreddamento: 15 min Corsa: 1,5 min Ciclo si raffreddamento: 2 min Cicli: 5 Velocità: 10 Hz Per l analisi qui presentata, il metodo sopra descritto si è rivelato ottimale per la macinazione di tessuti in PP. La resa è alta (80-90%) e durante il breve intervallo di macinazione il materiale non si riscalda troppo evitando la perdita di friabilità e la decomposizione. Il numero di cicli dipende dalla quantità di campione posto nella provette dalle dimensioni finali desiderate. Per escludere le particelle di dimensioni elevate, il materiale macinato può essere setacciato utilizzando, ad esempio, un setaccio da 500 µm. A) Preparazione del campione per l analisi HPLC di additivi Una quantità di campione macinato pari a 2 g circa viene pesata in un becker da 125 ml con accuratezza di 1 mg e vengono aggiunti circa 40 ml di toluene. Il campione viene portato ad ebollizione con agitazione costante. Dopo circa 30 minuti il materiale si è completamente disciolto, la soluzione viene quindi raffreddata lentamente fino a 50 C. Al fine di precipitare il polimero, 40 ml di metanolo vengono aggiunti agitando la soluzione. La miscela viene successivamente raffreddata a temperatura ambiente e filtrata con un filtro Nutsche ad aspirazione. Il filtrato viene fatto poi passare attraverso un filtro da 0,45 µm. Gli stabilizzatori necessari per l analisi sono quindi presenti in soluzione, pronti per l ossidazione e la separazione in HPLC. B) Analisi del Materiale: Test di INOC In dipendenza del contenuto di stabilizzanti, tra i 200 e i 400 mg di campione 10 mg di AIBN (iniziatore) vengono pesati nel becker di reazione. Successivamente 10 ml di Cumolo vengono aggiunti con una pipetta. Il becker è in connessione con l apparato di ossidazione. Il Cumolo estrae in modo

6 efficiente lo stabilizzatore contenuto nel tessuto macinato permettendone l ossidazione. Il Test INOC misura il tempo di consumo dell ossigeno durante la reazione. Dai dati ottenuti, viene generato un diagramma che consente la valutazione dello stabilizzatore contenuto nel campione. Conclusione Il Mulino Criogenico 6850 riduce in modo efficiente le dimensioni delle particelle di un campione, difficile da macinare evitando la degradazione termica del materiale, fino a dimensioni inferiori a 500 µm. Il tempo di preparazione del campione viene ridotto drasticamente a meno di 15 minuti grazie alla aumentata fragilità dello stesso a basse temperature.