GUIDA ALLE ESERCITAZIONI

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1 PARTE II GUIDA ALLE ESERCITAZIONI Vengono fornite esercitazioni per gli studenti sia pratiche che teoriche. Presentate come una serie di lezioni, queste attività sono raggruppate in cinque sezioni che sottolineano concetti fondamentali. La Sezione A spiega i concetti di base della biologia molecolare: la struttura e la funzione del DNA. Le Sezioni B e C si concentrano sulla manipolazione del DNA e sul suo trasferimento da un organismo ad un altro. Queste sezioni illustrano come una profonda comprensione dei sistemi biologici permetta di utilizzarli a nostro vantaggio. La Sezione D funge da connessione tra i campi della genetica e della biologia molecolare, illustrando come la comprensione dei processi biologici a livello molecolare possa spiegare le osservazioni genetiche a livello dell organismo. La Sezione E, novità di questa edizione, introduce le tecniche utilizzate nell analisi dei genomi e spiega come gli studi genomici siano applicati in modo da far progredire la nostra comprensione dell evoluzione e della variabilità individuale. La Sezione F si occupa di proteine, evoluzione e bioinformatica. Gli studenti si concentrano su un enzima comune a tutti i regni, attraverso attività pratiche in laboratorio e di esplorazione di risorse bioinformatiche in rete. Consultate le appendici e il sito e-cathedra per informazioni sulla biosicurezza in laboratorio, le apparecchiature, le ricette per le soluzioni e gli elenchi di fonti di ulteriori informazioni. A. STRUTTURA E FUNZIONE DEL DNA 6 Struttura del DNA Esercitazione Costruzione di un modello di carta del DNA 7 Duplicazione del DNA Esercitazione Duplicazione del DNA 8 Espressione dell informazione genetica Esercitazione Dai geni alle proteine Esercitazione Produzione di un antisenso: la regolazione dell espressione genica con l RNA Esercitazione avanzata Regolazione genica Esercitazione avanzata Antisenso ed interferenza da RNA 9 Modelli delle dimensioni dei genomi Esercitazione Dimensioni dei genomi dell uomo e di E. coli 10 Estrazione del DNA Esercitazione Estrazione di DNA batterico B. MANIPOLAZIONE ED ANALISI DEL DNA 11 Enzimi di restrizione Esercitazione Forbici che tagliano il DNA 12 Elettroforesi su gel Esercitazione La corsa del DNA 13 Analisi di restrizione Esercitazione Analisi di restrizione del DNA lambda 14 DNA ricombinante Esercitazione Plasmidi ricombinanti di carta 15 Fogli di lavoro di prove di analisi di restrizione Esercitazione Prova di analisi di restrizione 16 Rivelazione di sequenze specifiche di DNA: analisi di ibridazione Esercitazione Rivelazione di sequenze specifiche di DNA. Parte I. Pescare il DNA Esercitazione Rivelazione di sequenze specifiche di DNA. Parte II. Combinazione di analisi di restrizione e ibridazione Esercitazione Rivelazione di sequenze specifiche di DNA. Parte III. Ibridazione di Southern 17 La reazione a catena della polimerasi Esercitazione La PCR di carta 18 Sequenziamento del DNA Esercitazione Sequenziamento del DNA: i terminatori Lettura: I terminatori della catena come farmaci antivirali C. IL TRASFERIMENTO DELL INFORMAZIONE GENICA 19 La trasformazione Lettura: Trasferimento genico, Escherichia coli e malattie Esercitazione Trasformazione di Escherichia coli 20 La coniugazione Esercitazione Il trasferimento coniugativo della resistenza ad un antibiotico in Escherichia coli

2 Lettura: Trasferimento genico e diffusione della resistenza agli antibiotici 21 Trasduzione Esercitazione La trasduzione di un gene di resistenza ad un antibiotico 22 Trasferimento di geni nelle piante tramite Agrobacterium tumefaciens Esercitazione Agrobacterium tumefaciens: un ingegnere genetico dei vegetali D. BIOLOGIA MOLECOLARE E GENETICA 23 Genetica mendeliana a livello molecolare: dominanza e recessività Esercitazione Un avventura nel pelo del cane. Parte I 24 Genetica mendeliana a livello molecolare: un esempio di epistasi Esercitazione Un avventura nel pelo del cane. Parte II: i labrador gialli 25 Genetica molecolare umana Esercitazione Genetica molecolare umana Lettura: Genetica molecolare del cancro 26 Il medico investigatore : una storia di genetica in azione Esercitazione Genetica in azione E. GENOMICA 27 Confronto fra genomi Esercitazione Il confronto dei genomi Esercizio 1: Le STR possono provocare un RFLP Esercizio 2: La PCR può rivelare differenze a livello di loci microsatelliti Lettura: Il DNA mitocondriale 28 Tipizzazione del DNA in medicina legale Esercitazione Tipizzazione del DNA in medicina legale Esercizio 1. Confusione all ospedale Esercizio 2. Un caso di paternità Esercizio 3. Il caso del pugnale insanguinato Lettura: Utilizzo forense del DNA: un caso archeologico 29 Mappatura del genoma Esercitazione Mappatura di un gene responsabile di una malattia Lettura: Il Progetto Genoma Umano: scienza, applicazioni e problemi 30 Microarray ed analisi genomica Esercitazione Analisi dell espressione genica con i microarray Lettura: Genomica personale F. BIOINFORMATICA E ANALISI EVOLUTIVA DELLE PROTEINE 31 L amilasi, un enzima conservato durante l evoluzione Esercitazione Test per l attività dell amilasi 32 Elettroforesi delle proteine Esercitazione Elettroforesi di campioni di amilasi 33 Analisi dei cambiamenti evolutivi Esercitazione Costruzione di un albero evolutivo dell amilasi 34 Bioinformatica Esercitazione Un esplorazione della bioinformatica

3 G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 3 A. STRUTTURA E FUNZIONE DEL DNA Un principio base della biologia afferma che la struttura deve servire la funzione. Possiamo vedere esempi di questo principio quando osserviamo la struttura di un ala di un uccello in relazione al volo o la struttura dell occhio umano in relazione alla vista. La stessa relazione tra struttura e funzione sussiste a livello molecolare. Da nessuna parte tale relazione è più evidente che a livello della molecola del DNA. La sua struttura è meravigliosamente adatta alla sua duplice funzione: la replicazione e la traduzione dell informazione, oltre a permettere una facile regolazione attraverso numerosi meccanismi. Queste lezioni si concentrano sulla molecola del DNA. Modelli, simulazioni e discussioni illustrano la struttura del DNA, il compattamento e la conservazione, la replicazione del DNA, i processi della trascrizione e della traduzione, e alcuni aspetti della regolazione genica riguardanti il campo della tecnologia antisenso. Chiudono la sezione semplici metodi di laboratorio per estrarre DNA da Escherichia coli, tessuti vegetali, tessuti animali e lievito di birra disponibile in commercio. Per insegnare la struttura e le funzioni del DNA, non c è nulla di paragonabile ai modelli, sia che stiate insegnando a studenti di scuola media o a persone adulte. Sono disponibili in commercio molti modelli eccellenti per illustrare la struttura e la replicazione del DNA, oltre che la trascrizione e la traduzione. Se utilizzate già alcuni di questi materiali per spiegare la struttura del DNA e la sintesi proteica, è possibile che troviate alcune idee nelle esercitazioni sulla replicazione del DNA, sulla regolazione genica e sulla tecnologia antisenso, che potreste facilmente includere nelle vostre lezioni. Se non avete un modello di DNA di quelli reperibili in commercio, questa lezione inizia con un modello economico di carta che tutti i vostri studenti sono in grado di costruire.

4 4 Struttura del DNA 6 G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I Struttura del DNA Descrizione dell esercitazione a p. 177 In questa esercitazione gli studenti preparano un modello di carta di una molecola di DNA. Molti studenti, sia giovani che adulti, spesso trovano difficile visualizzare la struttura del DNA. Fare assemblare agli studenti un modello di DNA è probabilmente il modo più utile per comunicare informazioni concernenti la struttura del DNA a quell ampia fascia di studenti che imparano una cosa facendola. Se non disponete già di un modello di DNA di quelli in commercio, questa lezione fornisce un modello economico alla cui costruzione possono partecipare tutti gli studenti. Esiste anche un eccellente precedente storico per i modelli cartacei di DNA: Watson e Crick usavano modelli ritagliati e incollati quando provavano ad immaginarsi la struttura del DNA. L esercitazione è adatta a studenti di varie età e con capacità diverse. Noi l abbiamo utilizzata con successo in ambiti scolastici di diverso livello. Sebbene l esercitazione possa sembrare troppo semplice per studenti avanzati o universitari, la nostra esperienza suggerisce altrimenti. Anche se gli studenti di livello avanzato hanno solitamente familiarità con le coppie di basi, spesso non comprendono l orientamento antiparallelo dei due filamenti di DNA e in genere non hanno coscienza del fatto che le estremità 5 e 3 dei filamenti sono differenti. Procedimenti avanzati, quali il sequenziamento del DNA e la reazione a catena della polimerasi, dipendono da queste differenze e gli studenti devono comprendere questi aspetti della struttura del DNA prima di poter capire i metodi. L esame del modello sembra rendere le informazioni comprensibili a molti studenti più di quanto non lo facciano le illustrazioni di un libro. Questo semplice modello può anche aiutare a correggere un concetto frequentemente sbagliato riguardo al DNA, spesso causato dai disegni che utilizzano lettere al posto delle basi (come succede in molti disegni di questo libro). Il malinteso è che il DNA possa essere capovolto o ruotato all indietro, in quanto le lettere hanno un solo orientamento corretto. Potete usare questo modello per aiutare gli studenti a capire che il solo orientamento che ha senso in una molecola di DNA è l orientamento dal 5 al 3 della sua ossatura. Appendere il modello del DNA al soffitto o attaccarlo al muro è utile per insegnare le altre attività di questo libro, che richiedono quasi tutte di visualizzare una molecola di DNA. Questo modello fornisce agli studenti una struttura concreta che serve da base a concetti più astratti e difficili. Il modello cartaceo può essere utile nell insegnamento della replicazione, della trascrizione e della restrizione del DNA. Lezioni richieste: 1 o 2 lezioni di 45 o 50 minuti Introduzione La seguente discussione è intesa semplicemente come informazione per il docente. Non è necessario condividerla tutta (e neppure la maggior parte!) con gli studenti. A vostro giudizio valutate quanto sia adeguata per voi o quanto le vostre classi possano assorbirne. Vi potrà essere utile anche rivedere parti del Capitolo 4. Il DNA è il progetto della vita. Controlla la forma, le funzioni e l aspetto del corpo codificando le proteine che formano i mattoni e la malta dei tessuti, che svolgono attività metaboliche, che combattono le infezioni, che regolano la crescita e che sintetizzano grassi e pigmenti. Chimicamente il DNA è composto da piccole unità che si ripetono. L unità ripetitiva del DNA è piuttosto semplice; è composta da tre parti: lo zucchero deossiribosio, un gruppo fosfato ed una di quattro basi organiche, adenina, citosina, timina o guanina. Questa unità è chiamata nucleotide o, più propriamente, deossinucleotide (Figura 6.1). (L RNA è anch esso costituito da nucleotidi ma utilizza lo zucchero ribosio; perciò si dice che l RNA è costituito da ribonucleotidi.) Per costruire un polimero di DNA, molti deossinucleotidi vengono uniti da legami fosfodiestere tra i gruppi fosfato e gli zuccheri. I legami fosfodiestere formano un ponte tra il carbonio numero 5 della porzione di deossiribosio di un nucleotide e il carbonio numero 3 della porzione di deossiribosio del nucleotide adiacente. (La Figura 6.1 mostra la numerazione.) Usando i numeri del carbonio, si può parlare di direzione relativamente ai polimeri di DNA. Nella Figura 6.2, il trinucleotide è mostrato dal 5 al 3, dall alto al basso, poiché viene prima il carbonio 5 del

5 A. Struttura e funzione del DNA G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 5 O 5 O P O CH 2 OH Gruppo fosfato 4 C H H 3 C Figura 6.1 Il deossinucleotide. OH Deossiribosio Base (adenina, guanina, citosina, o timina) primo nucleotide. Immaginate di ruotare il trinucleotide invertendo l alto con il basso. Ora, viene prima il carbonio 3 con il gruppo OH del nucleotide T ; questo è l orientamento dal 3 al 5. O C1 H H C 2 H Base Le quattro basi del DNA sono di due tipi: purine e pirimidine. Adenina e guanina sono basi puriniche, e citosina e timina sono basi pirimidiniche. Queste basi sono capaci di formare due coppie specifiche: adenina con timina e citosina con guanina. Da notare che una purina si accoppia sempre con una pirimidina. Le basi puriniche sono più grandi di quelle pirimidiniche. Una coppia purina-purina sarebbe molto più spessa di una coppia pirimidina-pirimidina. Le due coppie di basi purina-pirimidina hanno invece le stesse dimensioni (Figura 6.3) e possono quindi adattarsi con precisione all interno dell elica del DNA, in qualunque ordine casuale. Le coppie di basi sono unite da deboli legami chimici chiamati legami idrogeno. (Vedi il Capitolo 4 per maggiori informazioni.) A causa delle strutture chimiche delle basi, adenina e timina risultano unite da due legami idrogeno mentre citosina e guanina sono unite da tre legami idrogeno. In una molecola di DNA, due polimeri di DNA complementari sono uniti da legami idrogeno tra queste coppie di basi. L ossatura zucchero-fosfato dei polimeri è orientata in direzione opposta: una va dal 5 al 3, e l altra dal 3 al 5. Infine, i due polimeri (normalmente chiamati filamenti) sono avvolti l uno sull altro per formare la famosa doppia elica (Figura 6.4). La struttura a doppia elica del DNA è adatta in modo perfetto all ambiente cellulare della molecola. La cellula è un ambiente a base d acqua, e molecole che sono cariche o elettricamente polari (quali i gruppi fosfato carichi e le molecole di zucchero) interagiscono velocemente con l ambiente circostante. Le basi organiche del DNA, invece, sono non polari e perciò idrofobiche (idrorepellenti). Esse sono molto stabili quando interagiscono con altre molecole idrofobiche anziché con l acqua. Nella doppia elica le basi sono rivolte l una verso l altra, lontano dal citosol acquoso. Tra le ossature di zucchero-fosfato, le piatte coppie di basi idrofobiche si impilano insieme, e queste cosiddette interazioni da impilamento stabilizzano ulteriormente la struttura a doppia elica. Sebbene le coppie di basi siano all interno dell elica, è possibile che le proteine cellulari percepiscano l identità e la sequenza di quelle coppie di basi. I bordi delle coppie di basi sono visibili per le proteine cellulari tra i filamenti a spirale dell ossatura di zucchero-fosfato. Il Estremità 5 OH O P O CH 2 G O O O H O P O CH 2 C O O Legame 3 Legame 5 Legame fosfodiestere O H O P O CH 2 T O O Estremità 3 OH H Figura 6.2 Un trinucleotide. 3 5 H H O H N C C C N H N C C C CH 3 Timina O H N Legami idrogeno H H N C N C C N C N Adenina Guanina N N C C H H 5 3 Ossatura zucchero-fosfato Figura 6.3 Coppie di basi complementari nel DNA. O H N N C C C N H N C C C H Citosina N H O H

6 6 Struttura del DNA 6 G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I Ossatura zucchero-fosfato C G A T A T G C T A C G G C T A A T Base Legami idrogeno Figura 6.4 Modello a nastro dell elica del DNA. bordo di ogni base presenta una diversa configurazione chimica verso l esterno, così che una proteina che interagisce direttamente col DNA può leggere la sequenza delle basi. In questo modo, la RNA polimerasi può riconoscere un promotore, le proteine repressore possono trovare le loro sequenze di legame, e le proteine della replicazione del DNA possono identificare i loro siti di inizio, le origini della replicazione (vedi l Esercitazione 7, Duplicazione del DNA). Se avete un modello tridimensionale del DNA, potete osservare le due scanalature che formano una spirale all esterno dell elica tra gli scheletri zucchero-fosfato. A causa della geometria dell elica, una di queste scanalature risulta più grande dell altra. Quella più grande è chiamata scanalatura principale del DNA; quella più piccola è la scanalatura secondaria. La caratteristica importante delle scanalature del DNA è che si tratta delle posizioni dove le proteine interagiscono con sequenze specifiche di DNA. La maggior parte delle interazioni DNA-proteina sequenza-specifiche attualmente note coinvolge il legame della proteina al DNA a livello della scanalatura principale. (Per un esempio di un interazione specifica proteina-dna, vedi I repressori lambda e Trp: proteine che legano il DNA nel Capitolo 4.) Quando la struttura del DNA fu proposta per la prima volta da Watson e Crick nel 1953, si pensava che la struttura ad elica che avevano descritto fosse fissa e immutabile. Da allora, abbiamo imparato che l elica del DNA può assumere forme leggermente differenti, può piegarsi ed attorcigliarsi e può anche svolgersi. Tutte queste forme diverse sembrano essere importanti per la funzionalità della cellula. La forma standard del DNA è chiamata elica di forma B. Ha 10,5 coppie di basi (bp, dall inglese base pairs) per giro completo, ed il suo centro di simmetria è lungo il centro delle coppie di basi. L elica di forma B è il tipo che verrà costruito dalla vostra classe. È stata però dimostrata l esistenza di altre due forme di elica chiamate A e Z. Il DNA di forma A ha circa 11 bp per giro completo, ed il centro di simmetria non è al centro delle coppie di basi ma al loro esterno tra gli involucri dello scheletro zucchero-fosfato (nella scanalatura principale). Il DNA di forma Z è ancora più differente. I DNA A e B sono eliche destrorse, mentre il DNA Z è sinistrorso. Ha circa 12 bp per giro di elica, e la geometria dei legami zuccherobase è alterata. Se volete dettagli sulla struttura delle eliche A e Z, vi preghiamo di riferirvi ad un testo avanzato. Il modello cartaceo del DNA, descritto sotto, permette agli studenti di costruire una grande elica di DNA. Il modello può essere utilizzato nelle lezioni successive sulla replicazione e sulla trascrizione del DNA, sugli enzimi di restrizione, sul sequenziamento del DNA, ecc. Gli studenti possono fare delle miniature di carta dei modelli di DNA per usarli in piccoli gruppi, se riducete lo schema dello stampo con una fotocopiatrice. (A seconda delle dimensioni dei modelli e la rigidezza della carta che utilizzate, i modelli più piccoli potrebbero non avvolgersi bene, ma funzioneranno per le esercitazioni sulla replicazione del DNA.) Il paragrafo Suggerimenti fornisce consigli sul modo in cui adattare il modello per le classi più giovani o per le classi più avanzate. Obiettivi L obiettivo di questa lezione è quello di costruire un modello di carta dell elica del DNA. Gli studenti svolgeranno questo compito preparando i singoli nucleotidi. I membri della classe quindi uniranno i loro nucleotidi per formare una doppia elica. Alla fine di questa esercitazione, gli studenti dovrebbero essere in grado di: 1. Descrivere la struttura del DNA. 2. Stabilire quali basi formano le coppie complementari del DNA. 3. Identificare le basi puriniche e pirimidiniche, e stabilire quali sono le più grandi. 4. Descrivere che cosa si intende con estremità 5 e 3 dei filamenti (solo per gli studenti avanzati).

7 A. Struttura e funzione del DNA G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 7 Materiali Copie delle sagome stampate (sito e-cathedra; cartella Modelli) Carta per modelli o carta per stampante di sei colori diversi Forbici, possibilmente una per studente Colla Cucitrice e graffette Estremità 5 Estremità 3 Preparazione Scrivete sulle sagome il colore che dovrebbero avere le basi, lo zucchero e il fosfato (per esempio, citosina, gialla; guanina, verde; adenina, rosa; timina, blu; fosfato, nero; deossiribosio, rosso). Fotocopiate o stampate copie delle sagome. Stampare o copiare su carta colorata risparmierà tempo in classe. Procedimento Per assemblare i nucleotidi (compito degli studenti) 1. Ritagliate la sagoma dei nucleotidi assegnati. 2. Mettete la sagoma sulla carta per modelli di colore appropriato e ritagliarla. 3. Etichettate il pezzo di carta come è etichettato il disegno (omettete il nome del colore). 4. Incollate la base azotata alla molecola di zucchero facendo combaciare i punti. 5. Incollate il gruppo fosfato sul modello facendo combaciare gli asterischi. 6. Il docente unirà i nucleotidi per formare un elica. Per assemblare l elica (compito del docente) Affinché l elica risulti regolare, dovete tener conto di quanti nucleotidi di ciascun tipo sono disponibili. Un modo semplice per farlo consiste nell utilizzare esattamente la metà di tutte le A, le T, le C e le G per costruire il primo filamento (mettete le basi in qualunque ordine); così sarete sicuri di avere il giusto numero di basi complementari per assemblare il secondo filamento. Per costruire il primo filamento, cucite con punti metallici il gruppo fosfato in corrispondenza del carbonio 3 sulla molecola del deossiribosio (guardate la Figura 6.1 per i numeri degli atomi di carbonio, le posizioni sono indicate da quadrati sulle sagome). Assemblate il fosfato con gli zuccheri lato destro in alto (i gruppi fosfato saranno rivolti verso l alto; questo orientamento sarà dal 5 al 3 ). Figura 6.5 Un segmento non avvolto del modello assemblato. Per assemblare il secondo filamento, uno studente deve tenere in mano il primo filamento. Chiedete ai vostri studenti quale nucleotide possa appaiarsi col primo nucleotide. Poi selezionate quel nucleotide, rovesciatelo per simulare l orientamento dal 3 al 5 (il gruppo fosfato dovrebbe essere rivolto verso il basso). Ricordate alla classe che i due filamenti di un elica vanno in direzioni opposte. Regolate la posizione del nucleotide, e fissate con graffette il gruppo fosfato alla posizione 3 dello zucchero, sovrapponendoli in parte come rinforzo. Costruite le coppie di basi fissando le due basi insieme; sovrapponetele per ottenere una buona resistenza. Chiedete agli studenti quale dovrebbe essere il nucleotide successivo. Unitelo al precedente fissando il gruppo fosfato alla posizione 3 dello zucchero. Continuate finché non avrete completato il secondo filamento (Figura 6.5). Per costruire l elica, avvolgete la scala di carta. Il risultato sarà migliore se tenete la scala in verticale mentre esercitate la torsione; fate tenere un estremità ad uno studente oppure appendete l elica al soffitto. Alcuni docenti decorano le loro classi con i modelli, facendoli correre lungo i muri e attaccandoli al soffitto. Tenete l elica nella vostra stanza come modello avvolto o disteso. Sebbene l elica sia una rappresentazione migliore del DNA, la forma distesa illustra le caratteristiche più importanti, la sequenza lineare dei nucleotidi e la complementarità dei filamenti.

8 8 Struttura del DNA 6 G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I Suggerimenti Utilizzate questa esercitazione solo per gli studenti principianti. Le domande possono essere utilizzate per qualunque classe, sebbene alcune di esse siano piuttosto semplici per studenti avanzati. Giudicate voi se utilizzare le domande più avanzate per i vostri studenti. Potrebbe essere utile ritagliare i modelli in una lezione ed incollarli il giorno successivo. Dividete le classi in gruppi. Assegnate ad ogni gruppo un nucleotide, il fosfato o lo zucchero da ritagliare. Assicuratevi che li etichettino in modo appropriato. In una classe media, fate ritagliare agli studenti tutti e quattro i nucleotidi. In una classe sopra la media, non dite agli studenti come assemblare il modello (non fate loro consultare il foglio dell esercitazione). Lasciate che lo scoprano da soli. Gli studenti possono essere divisi in piccoli gruppi e si può chiedere loro di fare delle miniature delle molecole di DNA utilizzando sagome di dimensioni ridotte. Due riduzioni del 64% delle sagome producono una dimensione ancora valida, ma fate attenzione perché a questa scala una molecola di DNA costruita con carta pesante non si avvolge bene. Potreste voler provare con carta più sottile se volete che gli studenti costruiscano modelli avvolti da usare individualmente. (Modelli distesi che abbiano le dimensioni di un banco sarebbero ottimi per l esercitazione sulla replicazione del DNA.) Alle classi di livello avanzato può essere richiesto di modificare questo modello molto semplice per renderlo più accurato. Gli studenti dovrebbero marcare tutti i gruppi funzionali sullo zucchero e numerare gli atomi di carbonio per determinare le estremità 5 e 3. (Guardate il materiale introduttivo per la numerazione.) Si può chiedere loro di creare sagome migliori affinché le basi azotate simulino correttamente le strutture a singolo e doppio anello delle purine e delle pirimidine. Questi studenti possono anche costruire piccoli modelli individuali. La replicazione del DNA può essere insegnata con questo modello facendo preparare altri nucleotidi agli studenti, simulando lo svolgimento dell elica, e costruendo nuovi filamenti. (Vedi la lezione successiva, La duplicazione del DNA.) Il grande modello a elica è anche utile per introdurre gli enzimi di restrizione (vedi l Esercitazione 11, Forbici che tagliano il DNA); potete costruirlo come un palindromo e tagliarlo per creare estremità nette o adesive. Potete anche far riferimento alla grande elica durante l Esercitazione 9, Dimensioni del genoma umano e di E. coli per ricordare agli studenti la struttura della molecola del DNA. Usate la vostra immaginazione per trovare altri modi di impiegare questo modello economico. Risposte alle domande per gli studenti 1. Timina 2. Citosina 3. Il nucleotide (deossinucleotide) 4. Una doppia elica 5. Adenina e guanina 6. Citosina e timina 7. A causa della chimica delle basi; a causa delle esigenze di spazio dell elica 8. Deossiribosio Risposte alle domande avanzate 9. TCGAGTC 10. C, perché il filamento opposto è antiparallelo al filamento dato. Nella risposta alla domanda 9 la sequenza dovrebbe essere nella direzione dal 3 al In 100 bp ci sono 200 basi. Ci sono 45 citosine quindi ci sono anche 45 guanine (così si spiegano 90 basi). Nella molecola ci sono altre 110 basi, A e T. Ci deve essere un egual numero di A e di T, dal momento che si appaiano tra loro. Perciò ve ne sono 55 di ognuna.

9 A. Struttura e funzione del DNA G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 9 7 Duplicazione del DNA Descrizione dell esercitazione a p. 179 La duplicazione del DNA è un argomento solitamente presentato nei corsi di biologia di primo livello. Il fatto essenziale della duplicazione del DNA è che le regole dell accoppiamento delle basi rendono molto facile la generazione a partire da un elica di due nuove eliche identiche. Questa informazione fondamentale costituisce tutto ciò che è realmente necessario conoscere per i giovani studenti riguardo alla duplicazione. Studenti più avanzati che affronteranno il sequenziamento del DNA e la reazione a catena della polimerasi devono avere una conoscenza un po più approfondita della duplicazione del DNA, in modo da poter comprendere queste interessanti applicazioni. L approccio scelto in questa lezione è quello di fornire informazioni dettagliate al docente nel materiale introduttivo e quindi di dividere l esercitazione in due parti. La prima è pensata per gli studenti più giovani; gli studenti di livello più avanzato eseguiranno entrambe le parti della lezione. La prima parte della lezione descritta sotto è una semplice (e necessariamente poco accurata) simulazione su carta della duplicazione del DNA. È comunque sufficiente per la maggior parte degli studenti di primo livello, dal momento che mette in evidenza il fatto che i due filamenti della doppia elica parentale vengono utilizzati come stampo per sintetizzare i due filamenti figli. I modelli cartacei di DNA descritti in questa sezione possono essere utilizzati nell esercitazione. Se avete a che fare con studenti più esperti usate l esercitazione di base come punto di partenza e quindi introducete un immagine più accurata della duplicazione del DNA tramite la seconda esercitazione. La seconda esercitazione è una lettura per lo studente sulla DNA polimerasi, l enzima centrale della duplicazione del DNA. Questa lettura fornisce quei dettagli di cui gli studenti avranno bisogno per comprendere le lezioni successive. Contiene domande, una delle quali richiede l uso delle informazioni derivate dalla lettura al fine di identificare le inesattezze nel modello semplice che hanno appena utilizzato. Potete fornire loro le informazioni aggiuntive che riterrete necessarie. L informazione di base nell introduzione seguente contiene molti più dettagli sulla duplicazione del DNA di quelli che è necessario condividere con gli studenti e sono stati riportati soltanto per vostra informazione. I due aspetti della sintesi del DNA che gli studenti avanzati devono conoscere (se faranno le esercitazioni sul sequenziamento del DNA e/o sulla reazione a catena della polimerasi) sono che la sintesi è unidirezionale e che richiede assolutamente un primer. Lezioni richieste: 1 Background Tutti gli organismi devono copiare le loro informazioni genetiche, sia durante la divisione cellulare che per la trasmissione alla loro progenie. Questo compito cruciale è svolto da un gruppo di proteine che agiscono insieme, ma il protagonista è l enzima DNA polimerasi. La DNA polimerasi seleziona i nuovi nucleotidi corretti verificando che il nucleotide si accoppi correttamente con la base dello stampo e quindi forma il nuovo legame fosfodiestere unendo il nuovo nucleotide alla catena di DNA in crescita. Non è sorprendente che le caratteristiche della DNA polimerasi determinino le caratteristiche generali della duplicazione del DNA all interno della cellula e in provetta. Nella reazione di sintesi del DNA, un deossinucleotide in entrata si lega alla polimerasi. Questo nucleotide deve essere in forma trifosfato; l enzima non lega mono- o difosfonucleotidi per l incorporazione nel DNA. (Un poco di terminologia: una molecola nucleotidica consistente solo dello zucchero e della base è chiamata nucleoside; i nucleotidi sono talvolta indicati come nucleosidi monofosfato, difosfato, o trifosfato per specificare quanti gruppi fosfati sono attaccati.) Successivamente la polimerasi controlla se il nucleotide in entrata si accoppia correttamente con la base dello stampo. Se lo fa, l enzima forma un legame tra il primo dei tre fosfati sul carbonio 5 del nuovo nucleotide ed il gruppo 3 ossidrile (OH) sull ultimo nucleotide della catena in crescita (Figura 7.1). La formazione di questo legame lascia uno dei gruppi fosfato nella catena in crescita e libera una molecola di fosfato inorganico, un pirofosfato, con gli altri due atomi di fosforo.

10 10 Duplicazione del DNA 7 G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I Infine, molte polimerasi, ma non tutte, possiedono anche una funzione di correzione di bozze che controlla il nuovo accoppiamento di basi per verificare che sia accurato. Se la nuova base non si appaia correttamente con la base dello stampo, allora il nuovo nucleotide viene rimosso dalla catena, e l enzima prova di nuovo. Le polimerasi prive della capacità di correzione delle bozze, quali le trascrittasi inverse, accumulano più errori durante la sintesi del DNA delle polimerasi che possono fare tali controlli. Quanto frequentemente le DNA polimerasi commettono errori nella duplicazione del DNA? Secondo studi in vitro, l enzima di Escherichia coli aggiunge una base sbagliata una volta ogni 10 5 o 10 6 coppie di basi, ma la sua capacità di controllare e correggere i propri errori porta la sua percentuale di errore finale al di sotto di un errore ogni 10 8 bp. All interno della cellula, ulteriori enzimi di correzione degli appaiamenti non corretti abbassano la percentuale di errore in vivo ad uno ogni bp. Il genoma di E. coli contiene circa 4, bp, così il batterio commette meno di un errore per divisione cellulare durante la duplicazione del DNA. Al contrario, la trascrittasi inversa dei retrovirus (come il virus dell immunodeficienza umana che causa l AIDS) è una polimerasi meno precisa dell enzima di E. coli, priva anche della capacità di correzione delle bozze. Questi enzimi commettono un errore nella duplicazione circa ogni 10 4 bp. Questa duplicazione del materiale genetico incline all errore è considerata la causa dell alta frequenza di mutazione del virus dell immunodeficienza umana. Due caratteristiche importanti della reazione della DNA polimerasi sono la direzione della sintesi del DNA e la necessità di un primer. Si noti (Figura 7.1) che l enzima unisce sempre il 5 fosfato del nucleotide entrante al gruppo 3 OH della catena in crescita. Questa caratteristica della duplicazione del DNA implica che la sintesi del DNA è unidirezionale, dal 5 al 3. L unidirezionalità presenta un problema per la duplicazione del cromosoma che verrà discusso più avanti. L altra caratteristica della reazione è che la DNA polimerasi deve avere un nuovo filamento in crescita da unire al nucleotide in entrata. Nessuna DNA polimerasi nota può iniziare a sintetizzare un filamento complementare su una molecola di DNA a singolo filamento nuda. Se il singolo filamento ha invece un corto oligonucleotide complementare appaiato in qualunque punto, la sintesi del DNA può iniziare all estremità 3 di quel nucleotide e continuare in direzione 5 3 fino alla fine del singolo filamento. In questo esempio, il singolo filamento lungo è il filamento stampo, ed il corto oligonucleotide complementare associato ad esso è chiamato primer. In generale, un primer è un oligonucleotide (o DNA o RNA; HO O P O O P Filamento figlio O O O P O O O 5 O O H 2 C O P 3 O O H 2 C O P O O OH Direzione dal 5 al 3 della crescita della catena O O CH2 O OH Filamento stampo Figura 7.1 La DNA polimerasi (non mostrata) controlla l appaiamento di un deossinucleoside in entrata con la base dello stampo e quindi forma un nuovo legame fosfodiestere tra il gruppo 5 fosfato del nuovo nucleotide ed il gruppo 3 ossidrile del precedente nucleotide. molte DNA polimerasi utilizzano primer di RNA) appaiato allo stampo con un gruppo 3 OH disponibile all estremità come sito di inizio della sintesi. La molecola stampo solitamente si estende molto oltre l estremità del primer. La natura ha escogitato molti modi per fornire primer per la sintesi del DNA, alcuni dei quali sono menzionati qui di seguito. Quando si lavora con le DNA polimerasi fuori dalla cellula (come nelle applicazioni biotecnologiche), per ottenere la sintesi del DNA è necessario fornire uno stampo con un primer appaiato, deossinucleosidi trifosfato, ed un appropriato tampone. La direzione della sintesi sarà sempre da 5 a 3 iniziando dall estremità 3 del primer. I ricercatori usano la selezione del primer per determinare se e dove avrà luogo la sintesi del DNA. Molto spesso, il primer è un oligonucleotide sintetico (vedi il Capitolo 5) aggiunto separatamente alla miscela di T G C A C G A T O O O O O 3 CH 2 O P O O O O O O CH2 P O O O O O CH2 P O O O O CH2 P O O CH 2 5

11 A. Struttura e funzione del DNA G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 11 reazione. Il DNA stampo e il primer possono essere appaiati tramite riscaldamento e raffreddamento (maggiori informazioni a questo riguardo si trovano nel Capitolo 16, Rivelazione di sequenze specifiche di DNA: analisi di ibridazione). Così, il ricercatore può decidere dove debba iniziare la sintesi del DNA e può sintetizzare un primer complementare che abbia la sua estremità 3 in quel sito (ammesso che conosca la sequenza del DNA della regione). La specificità del primer può essere utilizzata anche per determinare se una particolare molecola di DNA è presente in una miscela, per esempio, se in un campione di tessuto è presente un microrganismo che causa una malattia. Nei saggi basati sulla reazione a catena della polimerasi (vedi il Capitolo 17), vengono sintetizzati primer che si appaiano solo con il DNA dell organismo di interesse. Se l organismo è presente nel campione i primer possono appaiarsi e la sintesi del DNA potrà avvenire. Se l organismo non è presente, i primer non si appaieranno, e non potrà avvenire nessuna sintesi. La presenza o l assenza della sintesi del DNA viene utilizzata per determinare se l organismo di interesse è nel campione. La necessità di un primer appaiato è un potente mezzo di controllo su quando e dove la sintesi del DNA può avvenire in vitro. Il DNA cellulare normalmente non esiste in forma di singolo filamento con i primer appaiati. I cromosomi degli organismi sono generalmente molecole di DNA completamente a doppio filamento. In vitro, la DNA polimerasi non darà inizio alla sintesi del DNA su una molecola di DNA perfettamente a doppio filamento. I ricercatori fanno uso di manipolazioni, quali la denaturazione delle molecole a doppio filamento e l accoppiamento di corti primer ai filamenti singoli, affinché la sintesi del DNA possa avvenire in provetta. Come fanno le cellule a superare il problema? Il modo in cui le cellule riescono ad iniziare la duplicazione del DNA (e scelgono il momento opportuno e la controllano) è oggetto di ricerche in corso in molti laboratori nel mondo. Affinché la duplicazione del DNA abbia inizio, tre eventi principali devono avere luogo: (1) devono assemblarsi sul DNA le proteine della duplicazione, (2) l elica del DNA deve essere aperta per esporre le basi non appaiate al fine di usarle come stampo, e (3) deve essere fornito un primer. La seguente descrizione dell inizio della duplicazione del DNA è una generalizzazione che si basa su scoperte in sistemi diversi e non si applica a tutti i casi presi singolarmente. La duplicazione del DNA cromosomico ha solitamente inizio in siti specifici lungo il DNA chiamati origini della duplicazione. In generale, questi siti contengono specifiche sequenze di basi alle quali si legano speciali proteine di inizio della duplicazione. Le origini spesso contengono anche una regione composta principalmente di coppie di basi A-T, presumibilmente perché è più facile aprire una regione di un elica di DNA che è ricca di coppie A-T (solo due legami idrogeno legano la coppia A-T, mentre tre legano la coppia G-C). Le proteine di inizio si legano al sito di riconoscimento nell origine della duplicazione, e questo legame innesca l assemblaggio delle proteine della duplicazione. La doppia elica si apre a livello dell origine, o nelle sue vicinanze, ed un primer si appaia o viene sintetizzato. Il primer è solitamente di RNA. Può essere un trascritto della regione di origine che era stato sintetizzato in precedenza, o può essere un breve RNA speciale sintetizzato sul posto. Come potete immaginare, l uso di RNA per innescare la duplicazione del DNA significa che l inizio della duplicazione del DNA è spesso sovrapposto alla trascrizione, ed alcuni dei meccanismi di inizio meglio compresi sono piuttosto complicati. Molti scienziati stanno cercando di chiarire i differenti metodi di inizio della duplicazione del DNA in diversi organismi. Dopo che la doppia elica è stata aperta e il primer si è reso disponibile, la DNA polimerasi può iniziare a replicare il DNA. La polimerasi è assistita nel suo compito da proteine ausiliarie; le funzioni tipiche di queste proteine sono quelle di svolgere lo stampo a doppio filamento davanti alla polimerasi, proteggere qualunque regione a singolo filamento esposta (queste regioni sono molto vulnerabili alla degradazione da parte di enzimi cellulari), e aiutare a risolvere il problema della duplicazione sul filamento opposto. Qual è il problema sul filamento opposto? Il problema è la direzione della sintesi del DNA e la mancanza di primer. Il primer posizionato all origine permette alla DNA polimerasi di sintetizzare il DNA in direzione 5 3 allontanandosi dal primer e dall origine della duplicazione, utilizzando come stampo il filamento appaiato al primer. Cosa succede sul filamento opposto? Si sa che il filamento opposto viene replicato insieme al primo filamento poiché il complesso della duplicazione si muove allontanandosi dall origine. Dal momento che la sintesi del DNA può avvenire soltanto da 5 a 3, la duplicazione sul filamento opposto dovrebbe svolgersi all indietro verso l origine della duplicazione, nella direzione opposta. Tuttavia, immagini al microscopio elettronico del DNA in duplicazione mostrano chiaramente che la duplicazione del DNA avviene lungo entrambi i filamenti a livello di una forcella (una giunzione a forma di Y tra il DNA parentale non replicato ed i due filamenti figli) che si muove in una sola direzione lungo lo stampo di DNA parentale. Come fanno le cellule a coordinare la sintesi del DNA in direzioni opposte?

12 12 Duplicazione del DNA 7 G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I Primer 5 3 A Stampo del filamento leader DNA polimerasi Filamento leader Filamento ritardato 5 3 Nuovo DNA Stampo a singolo filamento del filamento ritardato B DNA parentale C 3 A 5 Figura 7.2 Il filamento ritardato è sintetizzato sotto forma di frammenti di Okazaki durante la replicazione del DNA. A Primer di RNA Nuovo DNA Precedente primer di RNA Fin dagli anni 60 si sa che la duplicazione del filamento opposto genera brevi frammenti, detti di Okazaki. Mentre un filamento complementare al primo filamento (il filamento leader) viene sintetizzato in un lungo tratto continuo che parte dal primer dell origine, il filamento complementare al secondo filamento (il filamento ritardato) viene sintetizzato in piccoli pezzi (Figura 7.2). Come avviene questa sintesi frammentata del filamento ritardato, e da dove vengono i primer? A B B C C La ricerca sulla duplicazione del DNA nel batteriofago T4 ha mostrato che, quando si assemblano le proteine della duplicazione del fago, due molecole di DNA polimerasi si uniscono al complesso. Una è responsabile della sintesi del filamento leader, e l altra è responsabile del filamento ritardato. Il modo in cui si pensa che queste due molecole funzionino insieme per replicare entrambi i filamenti del DNA stampo è mostrato nella Figura 7.3. Questa figura è complicata; osservatela mentre leggete la spiegazione nel testo. A, B e C sui filamenti di DNA nella figura sono semplicemente posizioni di riferimento per aiutarvi a seguire il movimento delle molecole della polimerasi lungo il DNA. Il complesso della polimerasi (con le sue proteine ausiliarie) si sposta lungo il DNA parentale per alcune centinaia di nucleotidi, sintetizzando il filamento leader mentre procede. Nel frattempo, l altro filamento stampo viene lasciato a singolo filamento e viene rivestito con proteine speciali che lo proteggono. Ad un certo punto, una delle proteine ausiliarie del complesso sintetizza un breve primer di RNA sul secondo filamento stampo. La seconda molecola di DNA polimerasi (la prima è occupata sul filamento leader) comincia la sintesi di un frammento di Okazaki all estremità 3 di questo primer. B A A B Nuovo primer di RNA Nuovo frammento di Okazaki B B A C C C C Precedente frammento di Okazaki A Osservate le prime due immagini nella figura. Il filamento di DNA in alto in ogni immagine è lo stampo per il filamento leader. Immaginate le due molecole di polimera- Figura 7.3 Questo modello per la replicazione contemporanea di entrambi i filamenti di DNA (descritto nel testo) è stato chiamato modello del trombone.

13 A. Struttura e funzione del DNA G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 13 si associate che si muovono da sinistra verso destra lungo il DNA (da A a B lungo la molecola), sintetizzando il filamento leader in un segmento continuo. Nel frattempo, lo stampo per il filamento ritardato si ripiega in una struttura a forcina. Ciò orienta correttamente lo stampo per la sintesi da 5 a 3. Si noti che il filamento di DNA ritardato viene sintetizzato da A verso B in direzione opposta al filamento principale. Le polimerasi non si muovono indietro verso l origine della duplicazione durante questa operazione ed è invece lo stampo per il filamento ritardato che viene tirato attraverso il complesso di duplicazione. Notate che l ansa che sporge alla sinistra della polimerasi diventa più grande passando dalla prima alla seconda immagine. Questo movimento ricorda il modo in cui la coulisse di un trombone si muove fuori dallo strumento. Quando i segmenti appena sintetizzati del filamento ritardato raggiungono il primer precedente, il nuovo DNA duplex viene rilasciato e viene sintetizzato un altro primer per iniziare il successivo frammento di Okazaki (guardate la seconda e la terza immagine nella Figura 7.3). Questo nuovo frammento di Okazaki si estenderà da B indietro verso il primer vicino ad A (quarta immagine). I primer di RNA saranno rimossi successivamente e sostituiti con DNA, e quindi i frammenti di Okazaki verranno uniti dall enzima DNA ligasi. Questo metodo apparentemente complicato di duplicazione del DNA è la conseguenza della direzionalità della sintesi del DNA e della necessità di primer. Tali vincoli governano l uso delle DNA polimerasi fuori dalla cellula. Queste importanti limitazioni possono però fornire ai ricercatori metodi per controllare la sintesi in vitro del DNA (come discusso sopra). Un ultimo problema della duplicazione causato dalla unidirezionalità e dalla necessità di primer è quello dell estremità. Osservate la Figura 7.2 ed immaginate cosa accade quando il complesso di duplicazione raggiunge l estremità della molecola di DNA (l estremità destra nell immagine). È chiaro che il filamento leader potrebbe essere replicato fino all estremità di un elica a doppio filamento, ma il filamento ritardato ha un altra volta un problema. In generale, non viene sintetizzato un primer di RNA all estremità terminale del cromosoma, ma molte strategie differenti superano il problema creato dalla specificità degli enzimi di duplicazione del DNA. Alcuni organismi hanno un DNA circolare. Altri organismi ancora (i virus in particolare) fanno uso di interessanti combinazioni di sintesi del DNA e ricombinazione genetica per ottenere la duplicazione completa del loro DNA. Gli eucarioti posseggono strutture chiamate telomeri alle estremità dei loro cromosomi. I telomeri contengono brevi sequenze ripetute di basi, nei vertebrati 5 -TTAGGG-3. I telomeri sono sintetizzati dalla telomerasi, un interessante enzima che porta una molecola di RNA che costituisce uno stampo per l unità ripetuta del telomero. La telomerasi è in realtà una forma di trascrittasi inversa che legge lo stampo di RNA e sintetizza repliche di TTAGGG. Nei vertebrati è espressa solo nelle cellule embrionali e nelle cellule della linea germinale. Quando la cellula comincia a differenziarsi, ogni ciclo di divisione cellulare porta a telomeri sempre più corti. Si pensa che l accorciamento dei telomeri sia la causa dell invecchiamento e della morte cellulare. Normalmente le cellule prelevate da un organismo e cresciute in coltura possono replicarsi per un certo numero di cicli di divisioni, e quindi muoiono. Nel 1998 alcuni ricercatori hanno trasformato cellule somatiche normali con la telomerasi ed hanno dimostrato che continuavano a dividersi in coltura. Si è trovato che la maggior parte delle cellule del cancro esprime telomerasi, che forse contribuisce alla loro capacità di continuare a dividersi. Se trovate interessante il processo di duplicazione del DNA e volete maggiori informazioni e dettagli, una buona discussione si trova su Biologia molecolare del gene (Zanichelli Bologna 2009), di Watson et al. Gli esperimenti sulla telomerasi sono descritti in un chiaro articolo di de Lange (Science 279: , 1998) e nell articolo originale di Bodmar et al. (Science 279: , 1998). Obiettivi Dopo l esercitazione di simulazione, tutti gli studenti dovrebbero essere in grado di: 1. Descrivere come la struttura a coppie di basi complementari permetta che due nuove eliche identiche siano prodotte a partire da una singola elica stampo. 2. Stabilire che la duplicazione del DNA è effettuata da proteine all interno della cellula. Dopo l esercitazione, gli studenti avanzati dovrebbero essere capaci di: 3. Spiegare che cosa si intende con l affermazione la duplicazione del DNA è unidirezionale. 4. Spiegare che cosa si intende con l affermazione la duplicazione del DNA richiede un primer. 5. Dare un nome all enzima centrale coinvolto nella duplicazione del DNA (DNA polimerasi). 6. Stabilire che le proteine di duplicazione purificate nelle giuste condizioni possono sintetizzare DNA in laboratorio.

14 14 Duplicazione del DNA 7 G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I Materiali Simulazione della duplicazione del DNA Modelli di DNA che mostrano separatamente lo zucchero, il fosfato, e le basi. Questi possono essere di carta colorata ritagliata dal modello presentato in una lezione precedente, modelli a palline disponibili commercialmente, o altri materiali. Ne servono abbastanza per permettere agli studenti di lavorare in piccoli gruppi o da soli. Preparazione Assemblate i materiali del kit o i ritagli di carta. Se state usando i ritagli, fotocopiate le sagome su carta di diversi colori e lasciate che ogni studente ritagli diversi zuccheri, fosfati, e basi (tutte e quattro) prima di iniziare l esercitazione. Se avete fatto modelli cartacei di DNA e li avete conservati, utilizzateli come stampi di duplicazione con i ritagli di carta. Procedimento 1. Simulazione della duplicazione del DNA Chiedete agli studenti perché una cellula dovrebbe voler fare una copia del proprio DNA. Chiedete se pensano che avrebbe importanza che la copia fosse una copia esatta. (L obiettivo è che si rendano conto che se un organismo deve generare una progenie identica a se stesso, deve trasmettere una copia del suo materiale genetico.) Chiedete agli studenti che cos è che copia il DNA all interno della cellula. Essi potrebbero non saperlo, ma la risposta corretta è gli enzimi, e gli enzimi sono proteine. Noi vogliamo che si rendano conto che tutto il corpo ed i processi biologici coinvolgono proteine e che il ruolo centrale del DNA è quello di trasmettere l informazione necessaria per fabbricare tutte queste proteine importanti. Assicuratevi che ogni studente (o gruppo di studenti) abbia la propria molecola di partenza (che sia un modello di carta che si sono preparati o un modello da un kit; la sequenza delle basi è totalmente ininfluente). Potreste chiedere agli studenti principianti come la molecola di partenza potrebbe venir utilizzata come modello per la sintesi del nuovo DNA. Dite agli studenti che i blocchi da costruzione del DNA sono i nucleotidi (uno zucchero, un fosfato, ed una base). Fate loro assemblare alcuni nucleotidi di vario genere a partire dai componenti dei loro modelli. Non è importante sollevare la questione dei nucleosidi trifosfato con gli studenti principianti. Spiegate ai vostri studenti (se non ci sono arrivati da soli) che la cellula utilizza ciascun filamento della molecola del DNA parentale come uno stampo (modello) per ottenere un secondo filamento. Se necessario, spiegate che la molecola parentale viene svolta (il termine corretto è denaturata o fusa) per esporre le basi non appaiate e che i nuovi nucleotidi vengono aggiunti uno alla volta, in ordine, a formare una catena complementare che si appaia con lo stampo. Gli studenti devono svolgere le loro molecole di DNA in modo che vengano esposte le basi non appaiate. Quindi devono costruire un frammento complementare su ogni filamento parentale, utilizzando i precursori nucleotidici. Verificate il lavoro degli studenti per assicurarvi che abbiano coppie di basi corrette nelle loro nuove molecole. Parlate agli studenti delle loro nuove molecole. Quelle nuove sono esattamente come la molecola parentale? (Dovrebbero esserlo.) Quanti vecchi filamenti ci sono in una nuova molecola? (Uno.) Quanti nuovi filamenti? (Uno.) Questa è una trattazione sufficiente della duplicazione del DNA per gli studenti principianti. 2. Attività di lettura dello studente Per una trattazione più dettagliata della duplicazione del DNA, comunicate ai vostri studenti avanzati che sebbene l esercitazione che hanno appena completato spieghi un punto veramente basilare, è imprecisa in quasi tutti i dettagli. Fate leggere agli studenti l Esercitazione 7, Duplicazione del DNA e fateli rispondere alle domande. Assicuratevi che capiscano che la porzione di figura stilizzata del nucleoside trifosfato nella figura rappresenta lo zucchero deossiribosio e la base col gruppo 5 fosfato ed il gruppo 3 OH mostrati (dal momento che sono i gruppi funzionali che partecipano alla formazione del nuovo legame). Potreste mostrare loro la Figura 7.1 dalla Guida per il docente. Chiedete agli studenti quali caratteristiche della semplice esercitazione di duplicazione non sono accurate (per esempio, la DNA polimerasi lega solo nucleosidi trifosfato per l incorporazione, sebbene il modello utilizzi nucleosidi monofosfato; il modello non usa primer, il modello non tiene conto della direzionalità della sintesi del DNA). Assicuratevi che abbiano notato la necessità di un primer e la direzionalità della sintesi del DNA. Potreste usare uno dei loro modelli per mostrare che la DNA polimerasi dovrebbe sintetizzare il DNA da sinistra verso destra in un filamento ma da destra verso sinistra sull altro per mantenere la direzione da 5 a 3. Giudicate voi quante informazioni fornire sui meccanismi della duplicazione dei cromosomi. Non è necessario (e sarebbe molto difficile) provare a preparare il modello dettaglia-

15 A. Struttura e funzione del DNA G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 15 to della duplicazione della Figura 7.3 con ritagli di carta, ma se volete, potete disegnare o riprodurre il modello per farlo vedere agli studenti. Risposte alle domande per gli studenti 1. La sintesi del DNA avverrà sugli stampi B e D. Gli stampi A e C non hanno primer. Sia in B che in D, la sintesi comincerà all estremità 3 del primer e continuerà verso destra (solo il corto filamento sulla sinistra nello stampo D può servire da primer, dal momento che non c è nessuno stampo che sporge oltre il corto filamento a destra). 2. Vedi sopra.

16 A. Struttura e funzione del DNA G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 17 8 Espressione dell informazione genetica Descrizione dell esercitazione a p. 181 In questa lezione gli studenti lavorano su trascrizione e traduzione, ai loro banchi con modelli di carta oppure interpretando dei ruoli e muovendosi nella stanza. Potete semplicemente fare un modello del processo nei procarioti o negli eucarioti oppure ampliare l esercitazione come mezzo per esplorare le differenze nei segnali che regolano i processi genetici e nelle strutture dei geni nei procarioti e negli eucarioti. Questa esercitazione costituisce anche una buona introduzione alla discussione sui vari significati della regolazione genica. Abbiamo fornito ulteriori informazioni di base sulla regolazione genica e idee per le esercitazioni di regolazione genica dopo la descrizione dell esercitazione di trascrizione/traduzione. Questo capitolo comprende anche un esercitazione avanzata sull interferenza da RNA (RNAi) e una sull RNA antisenso. Le informazioni di base per questa esercitazione seguono il materiale sulla regolazione genica. Lezioni richieste: da 1 a 3 Background Il DNA determina le caratteristiche di un organismo specificando le sequenze amminoacidiche (e pertanto le strutture e le funzioni) delle sue proteine (vedi il Capitolo 4 per una rassegna). Per dirigere la sintesi di una proteina, il DNA non deve solo contenere i codoni per ognuno degli amminoacidi di quella proteina, ma anche sequenze regolatrici che indichino al macchinario della sintesi proteica della cellula dove iniziare e dove fermarsi. Sebbene i procarioti e gli eucarioti utilizzino lo stesso codice genetico, hanno evoluto segnali regolatori differenti. La trascrizione e la traduzione vengono generalmente trattate nei testi di biologia della scuola superiore in dettagli talvolta eccessivi. La possibile eccezione a questa affermazione è la frequente mancanza di una discussione dei segnali e della regolazione dei processi genetici. La questione di come l RNA polimerasi identifichi l inizio di un gene viene spesso ignorata. Vi incoraggiamo ad includere i segnali regolatori nell insegnamento della trascrizione e della traduzione. Non è necessario entrare nei dettagli, ma vogliamo che gli studenti sappiano che la trascrizione e la traduzione non avvengono nel vuoto: i segnali ci sono e fanno parte del genoma di tutti gli organismi. Un altra singolare mancanza in molti testi della scuola superiore è la pratica comune di presentare la struttura, la replicazione, la trascrizione del DNA e la traduzione senza nessuna contestualizzazione che permetta di comprendere perché è importante produrre proteine. Il Capitolo 4 fornisce diversi esempi specifici della struttura e della funzione delle proteine, e la Sezione D Biologia molecolare e genetica mette in relazione diverse proteine con tratti osservabili. La prima importante regione regolatrice della sintesi proteica è il promotore, la sequenza di basi del DNA che l RNA polimerasi riconosce ed a cui si lega prima di iniziare la trascrizione. Senza un promotore, la trascrizione non avviene. I promotori procariotici ed eucariotici sono diversi, come lo sono le RNA polimerasi procariotiche ed eucariotiche. Un tipico promotore batterico consiste nella sequenza 5 -TTGACA separata da 17 basi dalla sequenza TATATT-3 (è ammessa una certa variabilità). I promotori eucariotici sono più variabili. Un componente del promotore eucariotico è la sequenza TATA, localizzata circa 30 basi a monte del punto di inizio della trascrizione nei lieviti e 60 basi a monte nei mammiferi. Questo componente è spesso chiamato TATA box. Solitamente, altri due componenti promotori si ritrovano molto più a monte della TATA box. Tali sono la sequenza CCAAT e una sequenza ricca di GC. Comunque ricordate dal Capitolo 4 che l RNA polimerasi eucariotica da sola non riesce a iniziare la trascrizione a partire da un promotore. I promotori eucariotici sono associati a diverse sequenze, gli enhancer, siti sul DNA dove vari fattori di trascrizione trans-attivanti si legano e stimolano la trascrizione (vedi il Capitolo 4). La trascrizione comincia a valle del promotore e continua fino al raggiungimento di un terminatore della trascrizione. Le sequenze di DNA dei terminatori sono complicate; ci sono classi diverse di terminatori con differenti strutture, e inoltre i terminatori procariotici differiscono da quelli eucariotici. La funzione di un terminatore è

17 18 Espressione dell informazione genetica 8 G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I quella di provocare un blocco della trascrizione del DNA da parte dell RNA polimerasi ed il rilascio dello stampo di DNA. La sequenza nucleotidica dell RNA messaggero (mrna) è tradotta in proteina a livello del ribosoma. La traduzione non inizia semplicemente all estremità 5 di un messaggio terminando alla sua estremità 3. Ulteriori elementi regolatori che dirigono i ribosomi nell inizio e nella fine della traduzione sono contenuti nell RNA stesso. Le basi dell RNA all estremità 5 e all estremità 3 non vengono tradotte in proteine. Nei batteri il principale di questi elementi regolatori è il segnale per il riconoscimento ribosomale. Nei batteri, questo elemento ha comunemente una sequenza 5 -GAGG-3 o 5 -AGGA-3 ed è localizzato da 8 a 13 nucleotidi a monte del codone di inizio. Il ribosoma riconosce l elemento e si lega all RNA in quel punto. Come avviene il legame? L RNA ribosomale batterico (rrna) contiene una sequenza di basi complementare all elemento di riconoscimento ribosomale (RRE) sull mrna, e l rrna e l mrna si ibridano a tale livello. Poiché l RRE è vicino al codone di inizio, il codone di inizio viene portato nella posizione appropriata per l inizio della traduzione. Il quadro non è altrettanto chiaro negli eucarioti. Nel modello più semplice, si pensa che i ribosomi eucariotici si leghino all estremità 5 dell mrna alla ricerca del primo codone di inizio per iniziare la traduzione. Esperimenti in alcuni laboratori suggeriscono che questo semplice modello non si adatti a tutte le situazioni. Sia nei procarioti che negli eucarioti la traduzione comincia col codone di inizio, AUG. Questo codone specifica l amminoacido metionina. I ribosomi procariotici ed eucariotici utilizzano una speciale forma modificata della metionina (metionina formilata in Escherichia coli) per iniziare la sintesi proteica. In E. coli, l inizio della sintesi proteica richiede anche tre proteine chiamate fattori di inizio. Negli eucarioti sono necessari molti altri fattori proteici. Una volta iniziata, la sintesi proteica continua lungo l mrna finché non viene raggiunto un codone di stop, a quel punto il ribosoma rilascia l mrna. I segnali genetici di regolazione coinvolti nella conversione delle sequenze di DNA in proteine (nei procarioti) sono riassunti nella Figura 8.1. Nei procarioti il prodotto della trascrizione è l mrna. Negli eucarioti, invece, l RNA polimerasi sintetizza un trascritto primario che deve essere ulteriormente modificato prima di poter funzionare da messaggio. Uno di questi passaggi di modificazione è lo splicing. DNA 3 5 Promotore RRE RNA 5 RRE Proteina ATG AUG Sequenza codificante Codone di stop Codone di stop Amminoacidi corrispondenti ai codoni 3 Terminatore Figura 8.1 I principali segnali di traffico genetico nei batteri. Questi segnali dicono alla RNA polimerasi dove cominciare e terminare la trascrizione, rendono il ribosoma capace di riconoscere l RNA, e dirigono il ribosoma a iniziare e terminare la sintesi proteica. Molti geni eucariotici, ma non tutti, contengono introni (vedi il Capitolo 4). Un introne è una sezione di DNA, inclusa in una regione di un gene codificante una proteina, che non viene rappresentata nell mrna o nella sequenza proteica. Il DNA intronico è trascritto nell RNA insieme con le regioni codificanti per formare un lungo RNA precursore. Gli introni sono rimossi dall RNA precursore tramite lo splicing, che avviene nel nucleo. I meccanismi dello splicing sono attualmente oggetto di ricerca. Sembra che ce ne siano almeno tre: uno per l RNA transfer (trna), uno per l mrna, ed uno per l rrna. Ciascun meccanismo utilizza una serie diversa di segnali per determinare precisamente quali sequenze devono essere rimosse dall RNA precursore. Un modello generico di splicing è mostrato nella Figura 8.2. Lo splicing accurato è molto importante; diversi tipi di talassemia (una malattia del sangue) nell uomo sono causati da mutazioni nei segnali di splicing del gene dell emoglobina che portano ad errori di splicing nell RNA dell emoglobina e quindi ad una sintesi non corretta della proteina. Per questa lezione La descrizione presentata qui è superficiale; ulteriori letture su un testo di biologia molecolare forniranno maggiori dettagli, se volete approfondire maggiormente. Non è ovviamente necessario trasmettere tutte queste informazioni agli studenti. Potete descrivere tanti elementi regolatori quanti ritenete opportuni; il promotore è sicuramente il più importante. I modelli da ritagliare (sito e-cathedra; cartella Modelli) permettono di simulare la sintesi proteica nei procarioti e negli eucarioti. Il modello più completo della sintesi proteica batterica dovrebbe comprendere il promotore, il terminatore e la sequenza di riconoscimento del ribo- 3 5

18 A. Struttura e funzione del DNA G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 19 DNA Esone Promotore Introne Esone Esone Introne Introne Trascrizione Esone Terminatore Figura 8.2 Splicing dell RNA precursore per produrre mrna. Gli esoni del DNA contengono la sequenza codificante la proteina. Giunzione di splicing RNA precursore Splicing mrna soma. Il modello eucariotico più completo dovrebbe comprendere il promotore, il terminatore e i segnali d inizio e fine di splicing (le giunzioni di splicing). Obiettivi Dopo questa lezione gli studenti dovrebbero essere capaci di: 1. Descrivere la funzione del DNA come materiale ereditario fondamentale che controlla l attività cellulare tramite il controllo del sistema enzimatico della cellula. 2. Descrivere la trascrizione e la traduzione. 3. Descrivere le funzioni del promotore e del terminatore. 4. (Opzionale) Confrontare i segnali procariotici ed eucariotici di regolazione dei geni. Materiali Forbici Fogli delle triplette del codice genetico del DNA/RNA stampati dal sito (e-cathedra; cartella Modelli), insieme a qualunque foglio desiderato di elementi regolatori. Varianti di questa esercitazione La maggior parte della discussione seguente è correlata ad una forma di esercitazione in cui gli studenti interpretano la trascrizione e la traduzione muovendosi per la classe. Alcuni insegnanti utilizzano regolarmente questa forma di esercitazione e la trovano utile. L esercitazione funziona anche come una dimostrazione: potete attaccare i cartoncini del DNA stampo sulla lavagna e mostrare come si forma l RNA. Un altra opzione consiste nel far lavorare gli studenti in coppia ai loro banchi. Riducete i disegni da ritagliare con una fotocopiatrice e raggruppateli in qualche foglio. Date ad ogni squadra una serie di fogli. Gli studenti possono ritagliare i modelli come semplici quadrati di carta per risparmiare tempo e quindi usare i ritagli per simulare la trascrizione e la traduzione ai loro banchi. Preparazione Modificate la preparazione secondo la variante della lezione che decidete di utilizzare. Prima della lezione, ritagliate le tessere del codice genetico fornite sul sito e-cathedra, cartella Modelli (o fatele ritagliare dagli studenti in classe). I ritagli di DNA sono in coppie complementari; un ritaglio contiene lettere piene; il suo complemento ha lettere contornate. Il filamento con le lettere contornate rappresenterà il filamento codificante del DNA; il filamento con le lettere piene sarà il filamento non codificante. Unite con delle graffette le tessere del DNA complementare in serie di due. Sistemate i ritagli in quattro pile: DNA, mrna, trna, ed amminoacidi. Mettete la sequenza di inizio (TAC) nella seconda posizione della pila del DNA e la sequenza di termine (ATC) in fondo. La tessera del promotore dovrebbe quindi essere posta sopra tutti i ritagli di DNA con i terminatori sul fondo. Decidete quale modello (procariotico o eucariotico) userete e quali segnali volete utilizzare. Ritagliate le tessere dei segnali. Se usate la tessera RRE, questa dovrebbe andare tra il primo ritaglio di DNA e la tessera di inizio (TAC). Se usate le tessere di inizio e di termine dello splicing, queste possono andare ovunque tra le tessere di inizio e di termine purché non sottoponiate a splicing l intero gene! Alcuni allineamenti campione per i modelli procariotici ed eucariotici sono mostrati nella pagina successiva (Figura 8.3).

19 20 Espressione dell informazione genetica 8 G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I Modello procariotico Promotore DSC RRE TAC DSC DSC... DSC DSC stop DSC terminatore Modello eucariotico Promotore DSC TAC DSC... DSC splicing DSC... DSC splicing DSC... DSC stop DSC terminatore Figura 8.3 Allineamenti campione di sequenze di DNA per la trascrizione. Le giunzioni di splicing ed il passaggio di splicing sono opzionali. DSC, tessera di sequenza di DNA con tre basi qualsiasi; TAC, tessera di DNA codificante con una sequenza di basi TAC (la corrispondente tessera codificante è ATG);..., qualunque numero di tessere di sequenza di DNA; stop, il codone di stop. Suggerimenti 1. Fotocopiate o stampate le triplette dei codoni su carta colorata usando, se possibile, colori diversi per DNA, mrna, trna ed amminoacidi. 2. Se possibile, plastificate le tessere così che possano essere usate più volte. 3. Assicuratevi che gli studenti capiscano l importanza delle proteine nel determinare le caratteristiche di un organismo prima di iniziare l esercitazione (guardate il materiale introduttivo). 4. Alcuni insegnanti incollano i ritagli su quadrati di carta più grandi e quindi fanno passare un filo attraverso buchi rinforzati nei quadrati per costruire dei cartelloni. Gli studenti possono appenderli sulle spalle come etichette durante la simulazione. Questi cartelloni possono essere riutilizzati di anno in anno. Procedimento per interpretare la trascrizione e la traduzione Nota: queste istruzioni sono rilevanti sia che pianifichiate di svolgere l esercitazione come una dimostrazione sia che facciate utilizzare agli studenti modelli di carta ai loro banchi. 1. Preparate la scena. Se state usando il modello eucariotico, può essere utile preparare la scena per gli studenti come segue. Il pavimento della classe, i muri, e il soffitto sono gli analoghi della membrana cellulare. Designate un area come nucleo, dove avviene la trascrizione. Designate un altra area come ribosoma, dove avviene la traduzione. Tutte le altre aree nella stanza che non sono nucleo sono il citoplasma. Importan te: se volete usare il modello di E. coli, ricordate che i batteri non hanno nucleo. Il cromosoma e i ribosomi sono associati con la membrana cellulare. Stabilite di conseguenza un area ribosomale, e lasciate che il DNA sia vicino alla membrana. Inoltre, ricordate che E. coli utilizza gli RRE ma non utilizza lo splicing. (Non dovete parlare di riconoscimento ribosomale, ma non mostrate lo splicing nei batteri.) Il modello eucariotico non usa gli RRE (lasciate che il ribosoma riconosca l estremità 5 del messaggio) e può usare lo splicing. Se siete molto ambiziosi ed avete tempo, potete utilizzare entrambi i modelli per far sì che gli studenti apprezzino le somiglianze e le differenze. 2. Distribuite agli studenti le coppie delle tessere della sequenza del DNA, gli elementi regolatori desiderati, ed i codici di mrna corrispondenti. Le lettere grandi sulle tessere si riferiscono alla prima lettera delle basi nucleotidiche (A = adenina, C = citosina, G = guanina, T = timina, e U = uracile). Non distribuite le tessere dei trna e degli amminoacidi fino al passaggio Ricordate brevemente la struttura del DNA se necessario. La parte informativa del DNA è dentro le basi appaiate, così la trascrizione non inizia finché l RNA polimerasi non svolge i due filamenti di DNA. L RNA polimerasi catalizza l appaiamento delle basi esposte del DNA con i nucleotidi complementari di RNA che capitano vicino. Gli studenti possono confondersi sul ruolo dei due filamenti di DNA. Un filamento (in questo caso rappresentato da tessere con le lettere contornate) è il filamento codificante. Esso contiene i codoni di tre basi che si ritroveranno nell mrna. Per portare l informazione codificante al ribosoma per la traduzione, la cellula fa una copia di mrna. Come può la cellula fare una copia del filamento codificante? Sintetizzando mrna complementare al filamento non codificante. Il processo è simile alla replicazione del DNA, eccetto che solo un filamento della molecola di DNA viene usato come stampo. L mrna generato è una copia del filamento codificante. Come fa l RNA polimerasi a sapere quale filamento utilizzare come stampo per la sintesi? La sequenza del promotore orienta correttamente l enzima.

20 A. Struttura e funzione del DNA G U I D A A L L E E S E R C I T A Z I O N I 21 Trascrizione 4. Gli studenti con le coppie di tessere del DNA si allineano nell area della classe designata come nucleo. Lo studente con la tessera del promotore dovrebbe stare sulla sinistra rispetto alla classe. Non è importante quale tessera di sequenza del DNA sia la prima dopo il promotore. Lo studente con la tessera del DNA con le lettere piene TAC e quelle contornate ATG (sequenza di inizio) dovrebbe essere la seconda sequenza di DNA (il terzo studente in assoluto, con il primo studente che ha il promotore). Il codice di DNA TAC produrrà il codone di inizio dell mrna, AUG. La tessera con le lettere piene ATC (sequenza di termine) dovrebbe essere la penultima; l identità dell ultima tessera non è importante. Se usate RRE per il modello di E. coli, lo studente deve stare tra il primo codone di DNA ed il TAC. Tutte le altre tessere di DNA possono essere mescolate in qualunque ordine. Per alcuni esempi riferitevi ai diagrammi. Gli studenti devono tenere le tessere davanti a loro con le lettere rivolte verso la classe. Le tessere con le lettere piene dovrebbero essere tenute sopra le tessere con le lettere contornate, con le basi complementari l una davanti all altra. Dovreste vedere sopra una fila di tessere con lettere piene e sotto una fila complementare di tessere a lettere contornate che formano i due filamenti di una sequenza di DNA. Questa è la rappresentazione della molecola di DNA a coppie di basi. Lo studente con il promotore dovrebbe stare sulla sinistra. 5. Designate uno studente per rappresentare l RNA polimerasi. Questo studente cammina verso lo studente promotore e gli dà la mano, intendendo che l RNA polimerasi ha riconosciuto l inizio di un gene. Dopo la stretta di mano, gli studenti DNA dovranno abbassare le tessere con le lettere contornate (la fila più bassa), esponendo uno stampo a singolo filamento per l RNA polimerasi. Essi dovrebbero tenere le tessere a lettere contornate per il successivo confronto con l mrna. 6. Ripassate le seguenti regole con gli studenti che hanno le tessere dell mrna. La citosina dell RNA si appaia sempre con la guanina del DNA. L uracile dell RNA si appaia sempre con l adenina del DNA. L adenina dell RNA si appaia sempre con la timina del DNA. La guanina dell RNA si appaia sempre con la citosina del DNA. 7. Utilizzando queste regole, gli studenti con le tessere dell mrna devono trovare i loro compagni di DNA. Fateli appaiare in ordine, iniziando con la prima tessera di sequenza di DNA e progredendo verso il terminatore, dove l appaiamento si interrompe. Quando il DNA e l RNA si saranno correttamente appaiati ed il terminatore sarà stato raggiunto, confrontate la sequenza dell RNA con la sequenza delle tessere di DNA a lettere contornate che gli studenti stanno tenendo (il filamento codificante del DNA). Gli studenti dovrebbero vedere che le sequenze delle basi delle tessere a lettere contornate e quelle dell RNA sono identiche, fatta eccezione per la sostituzione della U al posto della T nell RNA. La sequenza dell RNA è complementare alle tessere della sequenza di DNA con le lettere piene. 8. Gli studenti del DNA possono sedersi, lasciando una catena di RNA. (Potreste voler ricordare agli studenti che nella realtà la catena di DNA si estende oltre il terminatore in direzione del gene successivo, perciò è importante avere un segnale di terminazione per l RNA polimerasi.) Dite agli studenti che hanno effettuato la trascrizione. Essi hanno costruito una sezione complementare di RNA molto corta (più corta che nella realtà) che riflette perfettamente la sequenza di basi della molecola di DNA. Nota: dopo che gli studenti avranno appaiato le loro tessere, non sarà necessario che siano nell ordine mostrato nella Figura 8.4, ma gli appaiamenti DNA/mRNA dovrebbero combaciare verticalmente come nella figura. 9. Se volete simulare lo splicing, fatelo ora. Per simulare lo splicing, fate restare l RNA nel nucleo. Le due giunzioni di splicing e ogni altro studente tra di esse si allontanino e si siedano, e siano lasciate adiacenti tra loro le sequenze di RNA immediatamente a monte della prima giunzione di splicing e quelle a valle della seconda. DNA (codificante) CCG ATG AAT GTC GAG CTA TCC TAC GGC DNA (non codificante) GGC TAC TTA CAG CTC GAT AGG ATG CCG mrna CCG AUG AAU GUC GAG CUA UCC UAC GGC Figura 8.4 Appaiamenti di sequenze DNA/mRNA.