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Gaspare Di Gregorio
8 anni fa
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1 are clic sull'icona per inserire Unità Operativa: -SP Bioindustry Park S. umero olleretto Giacosa (TO) Metodi di analisi di secondo livello mediante spettrometria di massa per la conferma di campioni contenenti tracce di allergeni Maria Gabriella Giuffrida oma, 25 settembre 2013

2 Metodi di analisi di secondo livello mediante spettrometria di massa per la conferma di campioni contenenti tracce di allergeni Messa a punto del metodo per per la ricerca di latte in are clic sull'icona inserire tracce mediante spettrometria di massa l concetto dei signature peptides idea è di seguire alcuni peptidi appartenenti a proteine allergeniche o semplicemente a proteine dell alimento che si voglia cercare in tracce attraverso l uso della spettrometria di massa. e proteine vengono estratte dagli alimenti che si vogliono testare e digerite con un enzima (di solito tripsina) in modo da generare un pool di peptidi peptidi vengono separati mediante un sistema cromatografico HP accoppiato a spettrometri di massa (trappola ionica o tripli quadrupoli) e caratterizzati in base al loro rapporto massa/carica e il loro spettro di frammentazione ra tutti i peptidi generati si cercano solo quelli che in precedenza sono stati prescelti come peptidi caratteristici delle proteine dell alimento in tracce e per aumentare in sensibilità si cercano soprattutto frammenti specifici della loro frammentazione (Multiple eaction Monitoring MM)

alimento che si voglia cercare in tracce attraverso l uso della spettrometria di massa.

3 Metodi di analisi di secondo livello mediante spettrometria di massa per la conferma di campioni contenenti tracce di allergeni dei signature peptides arel concetto clic sull'icona per inserire e proteine vengono digerite di solito con l enzima tripsina che taglia specificatamente dopo le lisine (K) e le arginine () liberando i peptidi triptici D-D-W-H-T-S-S--G-T---P- -K-D-K--D---G-G--V-H K K K S S K Pool di peptidi triptici

proteine vengono digerite di solito con l enzima tripsina che taglia specificatamente dopo le lisine (K) e

4 are clic sull'icona per inserire aratteristiche ottimali per la selezione dei signature peptides teorici Grandezza compresa fra Dalton ssenza di cisteine Se è possibile assenza di metionine ssenza di modifiche post-trasduzionali (siti di glicosilazione e fosforilazioni) o missed cleavage ossia una sola arginina o lisina nella sequenza Una sequenza aminoacidica unica e caratteristica per l alimento

ssenza di modifiche post-trasduzionali (siti di glicosilazione e fosforilazioni) o missed cleavage

5 are clic sull'icona per inserire Studio delle sequenze aminoacidiche dell α-s1 caseina e della β-lattoglobulina di latte vaccino 1-D SDS PG atte magro ST (SM 1549) α S1-caseina 1 mklliltclv avalarpkhp ikhqglpqev lnenllffv apfpevfgke 51 kvnelskdig sestedqame dikqmeaesi ssseeivpns veqkhiqked 101 vpseylgyl eqllrlkkyk vpqleivpns aeerlhsmke gihaqqkepm 151 igvnqelayf ypelfrqfyq ldaypsgawy yvplgtqytd apsfsdipnp 201 igsensektt mplw β-lattoglobulina 1 livtqtmkgl diqkvagtwy slamaasdis lldaqsaplr vyveelkptp 51 egdleillqk wendecaqkk iiaektkipa vfkldainen Kvlvldtdyk 101 kyllfcmens aepeqslvcq clvrtpevdd ealekfdkal kalpmhirls 151 fnptlqeeqc hi

5 α S1-caseina 1 mklliltclv avalarpkhp ikhqglpqev lnenllffv apfpevfgke 51 kvnelskdig sestedqame dikqmeaesi ssseeivpns veqkhiqked 101 vpseylgyl eqllrlkkyk vpqleivpns

6 are clic sull'icona per inserire Studio delle sequenze aminoacidiche dell α-s1 caseina e della β-lattoglobulina di latte vaccino

7 Schema di uno spettrometro di massa

8 are clic sull'icona per inserire a formazione dello ione molecolare sempio di peptide triptico: SPDSMTK Peso molecolare: D Per effetto della protonazione può prendere un solo protone e pesare D oppure prendere 2 protoni e pesare Poiché gli spettrometri di massa registrano un rapporto massa su carica, i valori saranno: m/z m/z

6 D Per effetto della protonazione può prendere un solo protone e pesare 1410.

9 are clic sull'icona per inserire

10 nalisi MS/MS di un peptide da cui si ottiene lo ione molecolare [M+H]+ (a), lo spettro di frammentazione (b) e, quindi la sequenza amminoacidica (c). y4 y3 y2 y1 c) elative bundance le---phe---val---gln--ys b1 b2 b b [M+H] + a) b4 b) y y b m/z b4 y m/z

0 95 [M+H] + a) 90 100 b4 b) 90 85 y3 80 75 75 70 70 65 65 60 60 55 55 50 50 45 45 40 374.2 y2 275.2 b3 375.1 40 635.

11 are clic sull'icona perla inserire aratteristiche ottimali per selezione dei signature peptides in pratica Buon recovery della proteina di partenza dalle matrici alimentari Buona capacità di ionizzazione ed un alto segnale m/z Buona separazione cromatografica Buon spettro di frammentazione

partenza dalle matrici alimentari Buona capacità di ionizzazione ed un

12 are clic sull'icona per inserire nalisi dei peptidi triptici del latte in polvere ST (SM 1549) mediante /MSD Trap XT Plus gilent in modalità ullscan-uto-ms(n) m /z

13 are clic sull'icona per inserire m/ z

14 are clic sull'icona per inserire m /z

15 are clic sull'icona per inserire Messa a punto del metodo MM (Multiple eaction Monitoring) sui 3 peptidi selezionati

16 are clic sull'icona per inserire Messa a punto del metodo MM sui 3 peptidi selezionati m m m /z /z /z

17 urva di are per clicilsull'icona calibrazione latte in polvere ST 1549) (SM per inserire

18 are clic sull'icona per inserire POTOOO di STZO D BSOTT OT D DS Università Piemonte Orientale Provati diversi protocolli di estrazione delle proteine (kit S o Home made) Utilizzati 10 mg di polvere di biscotto e sciolti in 200 µdi tampone Scelto un tampone home made contenente H4HO3/(H4)2O3 +1% SDS a temperatura di estrazione ottimale è di 60 delle proteine in Metanolo/loroformio Precipitazione idisciolto il pellet in H4HO3 e pronto per la digestione triptica

200 µdi tampone Scelto un tampone home made contenente H4HO3/(H4)2O3 +1% SDS a temperatura di estrazione ottimale è

19 urva di calibrazione are sull'icona ottenuta con clic i biscotti prodotti per il progetto per inserire

20 300 ppm ist are clic sull'icona per inserire 150 ppm ist 75 ppm ist 25 ppm ist

21 are clic sull'icona inserire nalisi di fette biscottateper commerciali dichiarate senza latte (ma in etichetta può contenere tracce di latte )

22 nalisi di biscotti commerciali dichiarati senza latte are clic sull'icona per inserire (ma in etichetta può contenere tracce di latte )

23 are clic sull'icona per inserire GZMT o staff del M presso il Bioindustry Park S. umero -lena cquadro -Davide orpillo colleghi dell SP -ristina Baro -ristina amberti -orenzo apolitano GZ per l TTZO

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