BIOCHIMICA MOLECOLARE CLINICA

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1 Corso di Laurea Magistrale in BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE E SCIENZE BIOMEDICHE A.A BIOCHIMICA MOLECOLARE CLINICA Principi e tecniche molecolari per la diagnosi di patologie umane Prof. Patrizia Malaspina Dipartimento di Biologia Università di Roma Tor Vergata

2 Individuazione di alterazioni patologiche nel DNA RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) PCR (Reazione a catena della polimerasi) RealTime PCR (PCR in tempo reale) Sequenziamento

3 Enzimi di restrizione 1) Sequenza di riconoscimento (da 4 a 8 basi) detta palindrome: rispetto ad un asse di simmetria esiste la stessa sequenza di basi su entrambi i filamenti quando questi vengono letti in direzione 5-3 ; 2) Sporgenze al 5 o al 3 ; 3) Estremità coesive o non coesive; 4) Isoschizomeri (enzimi diversi che riconoscono la stessa sequenza); 5) Enzimi con sequenze di riconoscimento diverse ma che creano estremità compatibili (isoschizomeri) (es: BamHI e MboI).

4 Enzimi di restrizione

5 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Polimorfismo per lunghezza di frammenti di restrizione

6 Identificazione di RFLP attraverso Southern blot 1. Digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione 2. Separazione dei frammenti per elettroforesi su agarosio 3. Immobilizzazione DNA con trasferimento su membrana 4. Ibridazione con sonda marcata 5. Identificazione dell RLFP

7 Identificazione di RFLP attraverso Southern blot

8 Ibridazione con una sonda molecolare

9 Identificazione del peso molecolare delle bande dopo corsa elettroforetica DNA I: 19 mm = ~ 6,5 Kb 37 mm = ~ 1,2 kb DNA II: 20 mm = ~ 5 Kb 35 mm = ~ 1,6 kb 37 mm = ~ 1,2 kb

10 Identificazione di RFLP dopo corsa elettroforetica Dimensioni bande Non digerito: 15 kb EcoRI: 4, 5, 6 kb BamHI: 3, 5, 7 kb EcoRI + BamHI: 1, 3, 5 kb 3B 4E 5E 7B 6E 5B 3 B E E B

11 Southern blot, Northern, Western

12 Anemia falciforme

13 L anemia falciforme: 2 tipi di globuli rossi (a) Eritrociti contenenti emoglobina normale (A): Hb A Hb A (b) Eritrociti contenenti solo emoglobina mutate (S): Hb S Hb S Portatori Hb A Hb S :g. rossi a falce solo in condizioni di bassa concentrazione ossigeno

14 Gli alleli A e S sono codominanti Corsa elettroforetica

15 Identificazione dell allele S per la falcemia attraverso un RFLP nel gene beta della globina: quando la mutazione altera il sito di restrizione

16 Identificazione della segregazione di un allele patologico attraverso un RFLP quando la mutazione altera il sito di restrizione

17 APPLICAZIONI DELLA PCR Amplificazione a partire da 1 cellula umana = 6 pg DNA - Identificazione cellule tumorali, infezioni batteriche e virali; - diagnosi prenatale; - analisi del DNA antico; - analisi popolazionistiche (radice capello, cartellino con sangue, cellule mucosa buccale); - analisi medico-legali da tracce Amplificazione prima del clonaggio Studio di RFLP successivo all amplificazione del tratto genomico da analizzare; Individuazione delle mutazioni geniche con PCR allele specifica; Studio di loci di tipo VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) (microsatelliti)

18 PCR allele specifica Diagnosi patologie con alterazione di Singolo Nucleotide (SNP)

19 VNTR: MICROSATELLITI o STR (SHORT TANDEM REPEATS) Simple tandem repeats (1-5 bp) disperse nel genoma (blocchi inferiori a 100 bp) Variabilità inter individuale per numero di ripetizioni in tandem

20 Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide

21 ESEMPIO DI ALLELI DI UN LOCUS MICROSATELLITE NEL GENOMA Nel genoma umano ci sono circa: STR dinucleotidici STR trinucleotidici STR tetranucleotidici STR pentanlucleotidici 230 STR esanucleotidici

22 Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide

23 Tre loci microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore Marcatura di un primer di ogni PCR con diverso fluoroforo

24 Microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore Prodotti di ogni singola PCR marcati con coloranti fluorescenti

25 Microsatelliti analizzati con sequenziatore Tutti gli alleli noti per ogni locus microsatellite marcati con fluorofori

26 Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

27 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Esempio: un soggetto eterozigote C/T Coppia di cromosomi omologhi In quella particolare posizione del genoma (locus) gli individui possono essere classificati con 3 possibili genotipi: omozigoti C/C, omozigoti T/T, o eterozigoti C/T

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