RUOLI BIOLOGICI DELLE PROTEINE

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1 RUOLI BIOLOGICI DELLE PROTEINE

2 PROTEINE DI DIFESA Ig ed MHC SISTEMA IMMUNITARIO ANTICORPI (Immunoglobuline) PROTEINE DEL COMPLEMENTO PEPTIDI ANTIMICROBICI B-CELLS, T-CELLS (LINFOCITI con recettori MHC) MONOCITI (MACROFAGI) NATURAL KILLER (CELLULE NK) GRANULOCITI (NEUTROFILI, EOSINOFILI & BASOFILI) IMMUNITA ACQUISITA O ADATTATIVA IMMUNITA INNATA RISPOSTA UMORALE RISPOSTA MEDIATA DA CELLULE

3 IMMUNOGLOBULINE (Ig) / ANTICORPI Proteine prodotte dalle plasmacellule (LINFOCITI B attivati) Produzione stimolata da molecole estranee all organismo (NON-SELF) che possono essere polipeptidi/proteine, polisaccaridi, acidi nucleici o altre molecole (ANTIGENE) Le Ig riconoscono parti di queste molecole noti come DETERMINANTI ANTIGENICI Ogni cellula B produce un solo tipo di Ig con una particolare specificità per un dato determinante antigenico il repertorio di diversi Ig disponibili nell uomo è > Questa specificità deriva da una parte della sequenza primaria della molecola Ig (sito recettoriale). Gli anticorpi (Ig) si formano per SELEZIONE (dei prodotti di singoli geni) piuttosto che per ISTRUZIONE (adattamento di Ig all antigene). Ma abbiamo un numero limitato di geni (<30000). Non ereditiamo quindi geni per ogni Ig (Teoria germinale), ma piuttosto essi sono generati per ricombinazione somatica di un N limitato di componenti (Teoria della diversificazione somatica) Le cellule B esprimono 10 5 molecole analoghe alle Ig che producono sulla loro superficie, come recettori cellulari per antigeni. Quelle che esprimono Ig per le molecole del SELF sono soppresse nelle fasi precoci dello sviluppo. Quando una cellula B incontra un determinante antigenico complementare al sito di legame della sua Ig recettoriale scattano una serie di eventi che portano alla riproduzione rapida della cellula (selezione clonale)

4 Immunoglobuline e linfociti Il clone di cellule B attivate produce e rilascia Ig solubili in quantità, che possono riconoscere e legare lo stesso determinante antigenico riconosciuto dalla Ig recettoriale, nei microbi o tessuti non-self che lo esprimono. Le plasma cellule producono inizialmente un tipo di immunoglobulina noto come IgM, poi avviene la commutazione di classe, e sono espresse IgG, IgA, IgD o IgE, con specificità per lo stesso determinante antigenico ma diversi ruoli nell immunità. Dopo l eliminazione dell infezione, le plasmacellule muoiono, ma un certo numero di cellule B corrispondente a quel clone persiste in circolazione (MEMORIA). Questo fornisce una risposta più rapida in futuro verso lo stesso agente infettante) I LINFOCITI T sono attivati in maniera analoga ai linfociti B, ma forniscono una RISPOSTA CELLULARE Linfociti B Ig : risposta umorale efficace contro batteri, tossine batteriche e virus in circolo Linfociti T : efficaci contro cellule infette Caratteristiche comuni dei linfociti B e T : SELETTIVITA e MEMORIA

5 IMMUNOGLOBULINE - Strutture 1 a e 4 a L N V L H N C L V H s s s s s s s s s s C C 2 H C 1 H C 1 H s s s s s s V H C N C L H s s s s s s s s s s C 2 H V L L N-term C 1 H CDR V L A N H V H N L CDR C 3 H s s s s C 3 H C C C L A = ANTIGENE H C C-term C-term HEAVY CHAIN = CATENA PESANTE dominio CONSERVATO Porzione Fab CDR = COMPLEMENTARITY DETERMINING REGION (Regione ipervariabile) L V LIGHT CHAIN = CATENA LEGGERA dominio VARIABILE s s ponti disolfuro Papaina Porzione Fc oligosaccaride

6 Strutture 2 a e 3 (esempio di domini strutturali) CDR3 CDR1 CDR b 3c Dominio variabile Dominio conservato La diversità nel repertorio di Ig (> diverse molecole) è dovuta a: i) ricombinazione somatica di diversi frammenti genici che codificano per VC L e VC H con numerose varianti per ciascun frammento genico ( 3x10 6 combinazioni) ii) alternative splicing nelle catene VC L e VC H ( >10 8 ) iii) iv) diverse combinazioni di VC L con le VC H ipermutazione somatica delle regioni V (affinità per antigene aumenta di 1000 volte)

7 1 1 Il numero di segmenti è pertinente ad un individuo, e varia in diversi individui (polimorfismo genetico) V L C L (k o l) V H C H 1 C H 2 C H 3 L = leader seq.; V = variable (~100 res.); D = diversity; J = joining (~13 res.) ; C = constant; MC = membrane coding; SC = Secretion coding

8 Struttura molecolare Sito di legame per l antigene F ab Sito di legame per l antigene F ab F ab legame antigene F c funzioni effettrici oligosaccaride

9 Diversi tipi di Ig I diversi tipi di immunoglubuline che differiscono nella composizione delle C H (5 diversi isotipi, G,M,A,D e E e 4 subclassi per le IgG) Gli isotipi variano per tipo di C H e numero di catene, ponti disolfuro e glicosidazione I linfociti B esprimono inizialmente le IgM e successivamente, per un processo noto come isotype switching (commutazione di classe) esprimono uno degli altri isotipi La composizione dei domini C H conferisce specializzazione funzionale alle Ig a = oligosaccaride g m d e IgG (monomeriche) Siero ~ 80% IgM (pentameriche) precoci ~ 10% IgA (mono/di/ trimeriche) secrezioni esterne ~ 10% (lacrime, saliva, mucose) IgD (monomeriche) (?) recettore < 0.2% IgE (monomeriche) antiparassitarie < 0.02% (reaz. allergiche)

10 Gli Ig formano legami multipli con antigeni polivalenti poiché le molecole di IgG hanno 2 siti di legame per l antigene, possono formare legami crociati unendo assieme antigeni polivalenti I recettori sui linfociti B sono molecole tipo IgM modificate con un dominio di ancoraggio per la membrana. Un antigene polivalente causa l oligomerizzazione di recettori sulla superficie che innesca il segnale di attivazione attivazione linfocita B produzione IgM Isotype swithcing

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12 MHC (complesso maggiore d istocompatibilità) Le MHC di classe I presentano frammenti di proteine citoplasmatiche sulla superficie delle cellule (meccanismo taglia ed esponi ), incluso frammenti di eventuali patogeni intracellulari TCR (recettore cellula T) CELLULA T KILLER CD8 1) perforine 2) granzimi 3) apoptosi

13 Struttura Delle MHC Le MHC sono formate da quattro domini extracellulari, uno transmembrana ed uno intracellulare Il sito di legame per l antigene è una piattaforma recintata, formata da un -foglietto e 2 a-eliche Peptidi di 8-10 residui si legano in forma estesa, ancorati da due residui alle estremità (possono presentare milioni di frammenti diversi)

14 MHC-I e la presentazione dell antigene in cellule infette

15 MHC-I e linfociti-t killer

16 MHC di classe II e le cellule presentanti l antigene (antigen presenting, APC) Le MHC di classe 2 presentano antigene sulla superficie di cellule fagocitanti (APC) residui Una proteina estranea legata al recettore sulla superficie di linfociti-b endocitosi CD4 CELLULA T HELPER citochine fagocitosi Una particella estranea è fagocitata da macrofagi e cellule dendritiche altri linfociti

17 Cellule presentanti l antigene (APC) Linfociti B fagociti: macrofagi / cellule dendritiche

18 MHC-II e linfociti-t helper

19 Anticorpi come strumenti di ricerca determinanti antigenici epitopo discontinuo Indovina il determinante antigenico MVRGITVLAAVALMVGANNIPKLVPDDHYVNRVVGGQEAEE GSAPYQVSLQVALWGHNQGGSILSERWVLTAAHCLVGTDAE ELEVLVGTNSLKEGGQRYKADKLLYHSRYNSPQFHNDIGLV RLATPIKFSSTVKSIEYSENVVPVNATVRLTGWGRTSAGGS VPTKLQTIDLRTLSNEDGKKKSGNPGNVDIGHVVTLTRTGE GAKNGDSGGPGTNEDKVIGVVNFGVPCALGYPDGFARVSYY HDWIRTTIRNN idrofobico polare epitopo continuo

20 Produzione di anticorpi SPPS Antigen prediction Link to carrier (e.g. albumin) (inject with adjuvant) with antigen immunoassay Affinity Cromatography With Immobilized antigen

21 Produzione di anticorpi monoclonali MEDIUM

22 Utilizzo di anticorpi come strumenti per la ricerca - WESTERN BLOT blot a capillarità Elettro blot elettrodo elettrodo substrato prodotto colorato anticorpo specifico di coniglio anticorpo anti Fc di coniglio legato a un enzima

23 Western Tipi di blotting Northern Southern Southern: identifica un filamento di DNA blot utilizzando DNA complementare (es. identificare/isolare geni da DNA genomico) Northern: identifica un filamento di RNA blot utilizzando DNA complementare (es. determinare il livello di trascrizione di un gene) Western: identifica una proteina utilizzando un blot anticorpo specifico (es. determinare il livello di espressione di una proteina).

24 ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA indiretto e a sandwich colore colore

25 Anticorpi come strumenti di ricerca Epitopo + Ig elevata affinità e selettività interazione separazione identificazione diagnostica Identificazione sperimentale dell antigene colonne di affinità saggi ELISA Western blot (SDS-PAGE) Dot blot (cromatografia) I t controllo positivo

26 Glossario Antigene: macromolecola capace di reagire con i prodotti del sistema immunitario Determinante antigenico: Piccola parte di antigene che lega un anticorpo specifico. (detto anche epitopo). Una singola molecola di antigene può contenere diversi epitopi riconosciuti da anticorpi differenti. Antigenicità: (specificità antigenica) Capacità dell'antigene di combinarsi specificamente con un anticorpo Immunogenicità Capacità dell'antigene di indurre una risposta immunitaria (potere "immunogeno ): Aptene: piccola molecola (<10 kda) antigenica ma non immunogena. Diventa immunogena se legata a macromolecola carrier Adiuvante: sostanza in grado di stimolare e aumentare la risposta ad un antigene, senza manifestare essa stessa proprietà antigeniche. Anticorpi policlonali: miscela di anticorpi diversi fra loro ottenuti dall immunizzazione di un animale con un antigene che contiene diversi epitopi. Ogni anticorpo deriva da un diverso clone di cellule B. Anticorpi monoclonali: anticorpi identici fra loro prodotti da linee cellulari provenienti da un solo clone di cellule B (isolate specificatamente). I linfociti B sono immortalizzati fondendoli con cellule trasformate (ibridomi) (mab)