Alcune classi particolari di malattie genetiche

Transcript

1 Alcune classi particolari di malattie genetiche Malattie Mitocondriali Imprinting (sindrome di Prader-Willi e sindrome di Angelman) Malattie da triplette (X-fragile, SCA, Corea di Huntington). Concetto di premutazione ed anticipazione

2 Genetica mendeliana classica: Le mutazioni sono stabili e vengono trasmesse invariate da una generazione all altra. ECCEZIONE: Mutazioni instabili dovute ad espansione di DNA ripetuto

3 Triplette trinucleotidiche in tandem sono abbastanza comuni nel nostro genoma Ci sono 10 possibili triplette: AAC/GTT AAG/CTT ACT/AGT AGG/CCT AAT/ATT ACT/GAT ACC/GGT CAG/CTG ACG/ CGT CCG/CGG Alcune triplette CAG/CTG e CCG/GGC mostrano un comportamento anomalo: al di sopra di una certa soglia diventano estremamente instabili in mitosi e meiosi

4 MUTAZIONI DA DNA INSTABILE..CGGCGGCGG..!.. CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG..!..CAGCAGCAG..!.. CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG..! AMPLIFICAZIONE DI TRIPLETTE DI DNA CHE AVVIENE DI GENERAZIONE IN GENERAZIONE NUOVO MECCANISMO DI MUTAZIONE E DI TRASMISSIONE GENETICA

5 MECCANISMO!

6 Ci dovremmo aspettare sia espansioni che riduzioni di triplette." " " C e una tendenza all espansione!"

7 Genetica delle malattie da triplette: Concetto di premutazione Instabilita somatica e germinale Anticipazione

8 Concetto di Premutazione Ripetute al limite superiore del normale, che di per se non causano la malattia, ma possono espandersi e diventare patogenetiche nella generazione successiva ~500 >200 >200

9

10 Instabilita genetica normal: 5-37 premutation: (minimal transition threshold: 35) very late onset: adult onset: few - several hundreds congenital disease: greater than approx. 1000

11 Generic Pedigree of a Dominantly Inherited Due to CAG Repeat Instability

12 SCA1 INSTABILITA GERMINALE S. CHONG et al. 1995

13 Instabilita germinale

14 " Origine parentale della tripletta può " essere importante:" La trasmissione paterna ha un rischio aumentato di espansione nel caso delle malattie da poliglutamine (CAG codifica per glutamina): i casi piu gravi sono ereditati dal padre. Le grandi espansioni di triplette alla base della distrofia miotonica e della sindrome dell X fragile non vengono in genere trasmesse dal padre affetto: c è probabilmente una selezione a livello spermatico. Es. nella distrofia miotonica, madri lievemente affette possono avere figli con una gravissima forma di miopatia congenita"

15 Anticipazione = peggioramento della malattia da una generazione alla successiva Esempio nella distrofia miotonica: I I 1 = caratatta, a 50 anni insorge il il difetto muscolare II III II 2 = debolezza muscolare insorta nell adolescenza, cataratta, cardiomiopatia III 1 = neonato affetto da miotonia congenita ( insufficienza respiratoria ipotonia ecc.)

16 Zoghbi & Orr 1995 Relationship between the age of onset and the number of CAG repeats on the expanded alleles of individuals affected with SCA1.

17 PATHOGENIC EFFECT OF GLUTAMINE REPEATS Relationship between the age of onset and size of the CAG repeat in SCA1-3 An inverse correlation is observed between the size of expansion and age of onset The effect of expansion is different for each mutation

18 Qual e il meccanismo con cui l espansione da triplette causa la malattia?" 1. Perdita di funzione 2. Acquisizione di una nuova funzione" Posizione della tripletta nel gene

19 La tripletta espansa si trova nella regione codificante. Malattie di tipo I HD SCA1 DRPLA MJD 121 Affected Normal DRF 5 UTR Normal 3 UTR Affected SCA2 SBMA SCA6 Alleli normali tra 10-30, alleli espansi tra Il tratto poliglutaminico conferisce una nuova, patologica funzione alla proteina

20 Type I Trinucleotide Disease REDDY & HOUSMAN 1997

21 STORIA George Huntington medico americano; nel 1872 a 22 anni, descrisse il ballo di San Vito if by chance these children go through life without it, the thread is broken and the children and grand-children of the original shakers may rest assured that they are free from the disease George Huntington

22 Corea di Huntington" " Malattia neurologica devastante dovuta alla degenerazione dei neuroni del corpo striato Autosomica dominante Eta di insorgenza intorno ai 40 anni Sintomi iniziali irritabilita, depressione; progredisce con gravi disturbi del movimento (corea) e demenza" "

23 COREA DI HUNTINGTON Autosomica dominante Anticipazione Origine paterna delle forme piu gravi

24 Numero CAG <28 Normale, non a rischio Normale, ma la generazione successiva e a rischio Alcuni sviluppano la malattia, la generazione successiva e a rischio >40 Sviluppano la malattia

25 Huntingtin" " " Espressa in tutti i neuroni" Q" Funzione normale: "regolazione della trascrizione" " " " "protezione dalla apoptosi" " Espansione poliglutamine: acquisizione di una nuova funzione tossica per la cellula, tendenza a formare aggregati nucleari"

26 FORMAZIONE DI AGGREGATI INTRANUCLEARI"

27 Caratteristiche comuni delle malattie da poliglutamine: Progressivo fenotipo neurologico dovuto a perdita di neuroni Sono tutte caratterizzate da un acquisizione di funzione della proteina dovuta al tratto poliglutaminico Espressione ubiquitaria, ma fenotipo selettivo Il contesto proteico media la selettiva vulnerabilita neuronale

28 La tripletta si trova in regioni non codificanti. Malattie di tipo II FRAXA FA MD Full mutation Pre/protomutation Normal 1997 Current Opinion in Cell Biology Exon Exon Exon Intron Intron 5 UTR 3 UTR Alleli normali tra 5-50 ripetute, alleli espansi hanno centinaia, o migliaia di copie. La ripetuta inibisce l espressione del gene, causando una perdita di funzione della proteina

29 Type II Trinucleotide Disease REDDY & HOUSMAN 1997

30 SINDROME DELL X FRAGILE E una delle forme piu comuni di ritardo mentale ereditario, e rappresenta il 15-20% dei ritardi mentali legati all X. Incidenza: 1/4000 maschi; 1/8000 femmine Si trasmette come tratto legato all X recessivo con penetranza ridotta (80% nei maschi, 30% nelle femmine)

31 Fragile X Cromosome Quando i linfociti in coltura vengono privati di folato si evidenziano i siti fragili

32 QUADRO CLINICO Ritardo mentale" Facies anormale con mandibola prominente e grosse orecchie" Macroorchidismo" Anomalie comportamentali (iperattivita autismo) nei maschi"

33 Fragile X Syndrome

34 Fragile X Syndrome

35 (CGGCGGCGGCGG) ATG STOP 3 Gene FMR1 normale (CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG) ATG STOP 3 Gene FMR1 premutazione (CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG) ATG STOP 3 Gene FMR1 pazienti

36

37 FMR1 FMR1 codifica per una proteina con un possibile ruolo nel trasportare mrna dal nucleo alla macchina traduzionale Piu del 99% delle mutazioni in FMR1 sono dovute all espansione di una sequenza ripetuta CGG nel 5 non codificante del gene

38 Quando il numero di triplette supera la soglia di 230 l estremita 5 del gene FMR1 diventa ipermetilata e si blocca la trascrizione

39 Cause di variabilita fenotipica Dimensione della ripetuta CGG (premutazione/ mutazione) Metilazione Mosaicismo somatico (instabilita della ripetuta): un maschio con mosaicismo somatico avra generalmente un ritardo mentale piu lieve rispetto ad un individuo con la stessa espansione in tutte le cellule.

40 X FRAGILE: LA genetica rivisitata Legata all X Necessaria una mutazione in due step per l espressione della malattia Non ci sono nuove mutazioni: tutti i maschi affetti hanno madri portatrici Alto rischio di trasformazione dalla premutazione alla mutazione nella linea germinale femminile Possibile trasmissione da parte di maschi normali: attraverso le figlie portatrici sani ai loro nipoti

41 La tendenza all espansione della CGG si verifica solo quando la premutazione e trasmessa dalla madre

42 Quando la premutazione e trasmessa dal padre rimane stabile quindi le figlie femmine ricevono la premutazione senza che ci sia espansione ed i figli maschi ricevono l Y e non sono a rischio di ereditare la premutazione

43 REGOLA ECCEZIONE LE MALATTIE MONOGENICHE SI TRASMETTONO SECONDO PATTERN BEN DEFINITI (AD, AR, XL) EREDITA MITOCONDRIALE Es. Neuropatia ottica di Leber ASSENZA DI RISCHIO DI RICORRENZA NELLE MUTAZIONI DE NOVO MOSAICISMO GERMINALE Es. Osteogenesis imperfecta PER UN LOCUS AUTOSOMICO IL FIGLIO EREDITA UN ALLELE DA CIASCUNO DEI DUE GENITORI DISOMIA UNIPARENTALE Es. PWS e AS ENTRAMBI GLI ALLELI DI UN LOCUS AUTOSOMICO SONO UGUALMENTE ESPRESSI IMPRINTING Es. Prader Willi /Angelman LE MUTAZIONI SONO STABILI MUTAZIONI IN STABILI X Fragile

44

45 LA TERAPIA GENICA

46 1-Definizione e principi 2-Strumenti (Vettori) 3-Strategie 4-Trials Clinici 5-Successi e fallimenti

47 Terapia Genica Trattamento di Malattie attraverso il Trasferimento e l Appropiata Espressione di una Informazione Genica Funzionale in una Cellula Bersaglio Terapia Genica trattamento di malattie attraverso il trasferimento di materiale genetico [DNA RNA]

48 Il Dogma: DNA DNA nucleus cytoplasm RNA mrna AAAA PROTEIN

49 Strategie Terapeutiche germinale non accettata su base Etico Scientifica

50 Strategie Terapeutiche Terapia Genica In Vivo Terapia Genica Ex Vivo

51 Strategie Terapeutiche Trasferimento genico in vivo Fibrosi Cistica - Tessuto Specifico - Gene Specifico Tumore Cerebrale - Cellula Specifico - Gene Esogeno Emofilia - Tessuto Aspecifico - Gene Specifico

53 IDEALMENTE: Sistema di Trasferimento Genico Efficiente e Specifico Espressione Stabile, Costante/Modulabile Mancanza di Tossicita Non immunogeno Facilita di Produzione

54 Trasferimento Genico Metodi per Introdurre Acidi Nucleici in Cellule Vettore = Agente che Permette l Ingresso del Gene Terapeutico Vettori Virali Interazione con un Recettore della Cellula Bersaglio Vettori Non Virali Interazione Fisica con la Membrana Cellulare

55 Vettori Non Virali

56 Infezione (Virus) Trasduzione (Vettore)

57 I Virus Rappresentano Vettori Naturali Altamente Evoluti per il Trasferimento di Informazione Genica Estranea Ciclo Vitale del Virus Infezione / Replicazione

58 Conversione di un virus in un vettore: eliminazione dal genoma dei geni virali..

59 che vengono poi provvisti in trans nel processo di produzione del vettore

60 Trasferimento Genico Vettorologia: Sviluppo di Nuovi Agenti per il Trasferimento Genico Retrovirus Adenovirus Adeno-Associated virus

61

63 Malattie Genetiche Recessive Dominanti Malattie Multifattoriali Cancro Malattie Cardiovascolari Diabete Malattie Infettive

64 Espressione del Gene Terapeutico Espressione Stabile MALATTIE GENETICHE Espressione Regolata DIABETE Espressione Transiente TUMORI

65 Le Mutazioni Possono Causare: MUTANT DNA MUTANT mrna AAAA MUTANT PROTEIN Perdita di Funzione Acquisizione di Funzione

66 Strategia per Perdite di Funzione Virus Ricombinante: Vettore DNA nucleus cytoplasm mrna AAAA PROTEIN

67 Strategia per l Acquisizione di Funzione RNAi AAAA control.rnai VEGF.RNAi Decreased CNV w/ RNAi vs. VEGF Reich et al, 2003 Mol Vis

69 La Terapia Genica Rimane Confinata Alla Medicina Sperimentale Tuttavia

70

71

72

73

75

76 Ragazzo di 18 anni affetto iniettato con 6x10e11 particelle/kg Segni di sofferenza mentale 18 ore dopo la somministrazione, Coagulazione intravascolare disseminata e morte 96 ore dopo polmone fegato milza midollo

77 Il pz, OTC19, mostra innalzamento patologico di alcune citochine pro-infiammatorie. Questo studio ha stabilito la dose letale di Adenovirus ed ha raffreddato l entusiasmo nei confronti della terapia genica.

78

79

80 Terapia genica ex vivo in 10 pazienti con deficit di ADA e Immunodeficienza Severa Combinata: a 8 anni di distanza dal primo paziente trattato nessun serio evento avverso e tutti I pazienti fanno una vita normale senza dover assumere ADA

81 Primo trial clinico di terapia genica per una malattia erditaria della retina. Risultati a breve termine mostrano sicurezza ed efficacia alla dose bassa del trattamento

82 In conclusione. Come in ogni altra terapia sperimentale esistono difficolta tecniche e rischi ma si intravedono anche i primi successi clinici!