Ing. Anna Gaglianese

Transcript

1 Spettroscopia MRS Ing. Anna Gaglianese

2 La risonanza magnetica nucleare (NMR) è un metodo non invasivo utilizzato per ottenere immagini cliniche e studi sul metabolismo in vivo. 1. MRI (magnetic resonance imaging) : sfrutta l acquisizione del segnale dall acqua, e quindi degli atomi di idrogeno contenuti in essa per ottenere immagini anatomiche 2. MRS (magnetic resonance spectroscopy) utilizzata per l individuazione dei metaboliti. Permette di ottenere informazioni localizzate di carattere biomichico da tessuti e organi. Risonanza magnetica nucleare

3 La spettroscopia NMR misura l assorbimento di radiazione elettromagnetica a frequenza radio in molecole immerse in un forte campo magnetico (tipicamente idrogeno 1 H o carbonio 13 C o fosforo 31 P). Principi fisici

4 Le informazioni sulla presenza di determinati metaboliti vengono dedotte osservando il comportamento dei nuclei atomici. Sono infatti osservabili solo i nuclei che possiedono un momento magnetico nucleare di spin, e che quindi si comportano come l ago di una bussola che si può orientare in un campo magnetico applicato. Principi fisici

5 I nuclei 1 H e 13 C possiedeno uno spin risultante diverso da zero e possono presentare due orientamenti rispetto all azione di un campo magnetico statico B 0 esterno. I nuclei in eccesso allineati con il campo magnetico Bo sono quelli che permettono di generare il segnale NMR. B0 Principi fisici

6 B 0 Frequenza di precessione Equazione di Larmor: ω = γ Β ο Campo magnetico statico Principi fisici Rapporto giromagnetico Il moto di precessione dei momenti magnetici nucleari avviene con una frequenza proporzionale alla differenza di energia tra i due livelli detta frequenza di Larmor

7 Se i protoni posti nel campo magnetico statico B 0 vengono eccitati con un impulso a frequenza ω pari alla frequenza di Larmor si ha il fenomeno della risonanza magnetica nucleare Principi fisici

8 L energia assorbita dai nuclei viene lentamente ceduta agli atomi vicini a causa di fenomeni di rilassamento spinreticolo (con i dipoli delle molecole circostanti) e spin-spin (con i nuclei di idrogeno vicini) Il segnale raccolto è un segnale oscillante con frequenza ω, la frequenza di Larmor del nucleo in esame, che si smorza nel tempo e che viene detto FID (Free Induction Decay), libero decadimento dell induzione. Impulso di eccitazione RF Antenna (bobina) RF Principi fisici FID: Segnale ricevuto

9 Trasformata di Fourier: permette di passare dal grafico in funzione del tempo, il FID, al grafico in funzione delle frequenze, lo spettro NMR. Ciascun picco rappresenta la concentrazione di un determinato metabolita che risuona a frequenza f f Principi fisici

10 I passaggi essenziali per ottenere lo spettro NMR di un campione sono quindi i seguenti: 1) Introduzione del campione all interno di un forte campo magnetico Bo per orientare gli spin nucleari nella posizione allineata con il campo o contro il campo. 2) Applicazione di un impulso di radiofrequenza per produrre un eccesso di nuclei eccitati con lo spin in opposizione al campo (durata: alcuni microsecondi). Principi fisici

11 3) Registrazione del FID, il segnale emesso dai nuclei mentre gli spin nucleari ritornano alla situazione di equilibrio (durata: circa un secondo). 4) Elaborazione matematica dei dati al computer applicando la Trasformata di Fourier per ottenere lo spettro NMR in funzione delle frequenze. Principi fisici

12 Tutti i nuclei di un certo tipo risuonano però a frequenza diverse a causa di piccoli campi magnetici indotti dai legami con altri atomi H legato ad atomi poco elettronegativi. Gli elettroni di legame sono più vicini a H. Effetto di schermatura più forte: gli elettroni di legame producono un campo magnetico bi (in opposizione a Bo) che investe l'idrogeno. Spostamento chimico H legato ad atomi più elettronegativi. Gli elettroni di legame sono più lontani da H. Effetto di schermatura piccolo: gli elettroni di legame producono un campo magnetico bi (in opposizione a Bo) che investe l'idrogeno solo marginalmente.

13 In generale, idrogeni legati ad atomi più elettronegativi risultano deschermati quindi sentono un campo magnetico applicato più intenso e subiscono la transizione a frequenze maggiori e, nello spettro, si trovano più a sinistra, ad uno spostamento chimico più alto. Idrogeni legati ad atomi più elettronegativi risultano deschermati quindi sentono un campo magnetico applicato più intenso e subiscono la transizione a frequenze maggiori e, nello spettro, si trovano più a sinistra, ad uno spostamento chimico più alto. H deschermati sentono un campo magnetico più forte subiscono transizione a frequenze maggiori hanno spostamenti chimici maggiori H più schermati sentono un campo magnetico più debole subiscono transizione a frequenze minori hanno spostamenti chimici minori Spostamento chimico

14 Tutti i nuclei di un certo tipo risuonano quindi a frequenza diverse a seconda dei legami con altri atomi Il segnale NMR di ogni nucleo risulta spostato nello spettro a frequenze più alte o più basse a seconda del suo intorno chimico. Lo spostamento chimico è la differenza tra la frequenza (in Hz) del segnale NMR del nucleo in esame rispetto all assorbimento di un campione di riferimento: ppm (parti per milione) La molecola usata come riferimento e quella del TMS (tetrametilsilano (CH 3 ) 4 ) Essendo simmetrica è uguale su tutti gli strumenti indipendentemente dall intensità del loro campo magnetico. Spostamento chimico

15 Scala da 0 a 12 ppm (nucleo più utilizzato) Scala da 0 a 220 ppm (Frequenze di risonanza 13C molto bassa difficile da misurare) Spostamento chimico

16 Applicazioni e esempi clinici

17 La spettroscopia consente quindi di definire specie chimiche, strutture molecolari ed ambienti chimici in vivo. Le applicazioni della spettroscopia MRS sono molteplici e permettono la diagnostica di diverse patologie in diversificati tessuti: Tumori (cervello, prostata, addome) Metabolismo cardiaco Metabolismi in vari tessuti ( fegato, muscolo, rene) Applicazioni

18 STRUMENTAZIONE MRS in vivo: 1. Magnete per generare il campo statico B0 2. Bobina per inviare impulso a radiofrequenza 3. Bobina per ricevere il segnale FID 4. Working station per elaborare i segnali Strumentazione

19 MRI MRSI MRS Applicazioni

20 Misure del metabolismo cerebrale mediante 1 H MRS

21 1. Il primo passo consiste nel trasporto e nel metabolismo dei carburanti primari, e cioè glucosio, chetoni, aminoacidi e lipidi. 2. I frammenti formati subiscono un processo di ossidazione nel ciclo di Krebs, con conseguente formazione di ATP per fosforilazione ossidativa, all interno dei mitocondri. Un insuccesso a questo punto del processo, priva il cervello di ATP, portando alla formazione di lattato dal piruvirato. 3. L ATP viene sintetizzato in un complesso ad alta energia, e cioè la fosfocreatina PCr, dall enzima reversibile creatina chinasi. La PCr così formata è una fonte aggiuntiva di ATP per il cervello, perché rilascia creatina. Metabolismo ossidativo

22 Metabolita Spostamento chimico (ppm) N-acetilaspartato (primo picco, NAA1) 2.01 N-acetilaspartato (secondo picco, NAA2) 2.6 N-acetilaspartato (terzo picco, NAA3) 2.5 Creatina (Cr) 3.03 Colina (Cho) 3.22 Glucosio 3.36 Glutammato e Glutammina (Glx) Glx (secondo picco) Alanina 1.48 Acido γ-amminobutirico 2.9 Lattato (Lac) 1.33 Lipidi Spettro metaboliti

23 Creatina : Rappresenta la riserva energetica cellulare ed è un marker metabolico generalmente poco sensibile alle modificazioni indotte da diverse patologie: per questo motivo è possibile normalizzare alla creatina i valori degli altri picchi metabolici ed analizzare i dati in maniera semiquantitativa mediante l andamento dei rapporti NAA/Cr, Cho/Cr Lattato : Il lattato è il prodotto finale della glicolisi. Certi tumori come il glioma, presentano un aumento della concentrazione di lattato. Il picco di lattato indica inoltre una possibile interruzione del ciclo di Krebs. Alti livelli di Lac possono essere dovuti anche all infiltrazione di cellule infiammatorie. Significato clinico metaboliti

24 N-Acetylaspartato: rappresenta il picco più alto dello spettro cerebrale, a 2.02ppm. Come marcatore assonale, l NAA viene trasportato velocemente attraverso gli assoni, dal sito in cui avviene la biosintesi nei mitocondri neuronali. Di conseguenza questo metabolita è rilevabile anche nello spettro della materia bianca. La scomparsa del picco dell NAA indica una morte neuronale, presumibilmente irreversibile, e una lesione assonale, generalmente recuperabile. Glutammato e glutammina (Glx): Il glutammato fa parte del ciclo metabolico che porta alla accumulazione del lattato, e se presente in concentrazioni superiori a quelle richieste per la trasmissione neuronale può diventare una neurotossina. Valori anormali possono essere indicativi di epilessie o malattie neurodegenerative. Lipidi: più del 20% del peso bagnato del cervello è composto da lipidi, nella forma di membrane associate a mielina, fosfolipidi, sfingomielina e lecitini. I lipidi possono dominare lo spettro della risonanza in caso di infezioni, infiammazioni, necrosi di tumore. Colina: meno conosciute in termini di neurochimica. Somma di fosforilcolina e glicerolfosforilcolina, meno del 5% del picco è dovuto alla sola colina Myo-inositolo: Il myo-inositolo è prevalentemente concentrato negli astrociti all interno dei quali viene riconosciuto come il più importante osmolita e marcatore neuronale. Significato clinico metaboliti

25 Particolarmente utilizzata la spettroscopia protonica per le patologie del cervello umano NAA mi Cho Cr Glx ppm Spettro 1H corteccia occipitale

26 Spettro 1H : esempi

27 Soggetto sano Soggetto patologico Tipico spettro MRS in caso di tumore cerebrale avanzato (glioma). Scomparsa del picco dell aceticol-colina, livelli di cholina, creatina e myo-inositolo inferiori rispetto al soggetto sano (sinistra)(neurosurg Focus. 2003;15(1)) Esempi clinici: glioma

28 1 H MR spettro di un neonato a seguito di ipossia perinatale: presenza del picco del lattato (Eur. Jour. Rad. 2008; 67-2) Esempi clinici : ipossia postnatale

29 Corteccia cerebrale scimmia sana Corteccia patologica Cr Cr NAA NAA ppm ppm Esempi clinici: sclerosi multipla

30 Misure del metabolismo muscolare mediante 1 H MRS e 31 P

31 Il nucleo 31 P permette il riconoscimento dei gruppi fosfatici dell ATP rispetto a misure 1 H Metabolismo ossidativo muscolare: 1 H vs 31 P

32 Metabolismo ossidativo: misura dinamica mediante 31 P MRS

33 Paziente normale Paziente obeso IMCL:intra myocellular lipid EMCL:extra myocellular lipid Metabolismo muscolare: 1 H MRS

34 Metabolismo e Carbonio 13: nuove frontiere

35 Il [1-13 C]piruvato può essere iniettato all interno del paziente dopo essere stato iperpolarizzato per amplificare il segnale ricevuto. Esso è al centro di fondamentali vie metaboliche, dalle quali è possibile estrarre importanti informazioni diagnostiche. Iperpolarizzazione 13 C

36 1. L osservazione delle varie vie metaboliche in cui si inserisce il [1-13 C]piruvato iperpolarizzato iniettato, consente di monitorare lo stato di salute di organi e tessuti specifici. 2. Il piruvato si trova al centro di fondamentali vie metaboliche e cataboliche, esso rappresenta la chiave di accesso per il ciclo di Krebs in cui la sua conversione in lattato, alanina o bicarbonato dipende dallo stato di salute delle cellule. 3. Il piruvato, una volta entrato nella cellula muscolare, produce lattato ed alanina, che esprimono la generale attività metabolica della cellula, ma anche bicarbonato il quale è in equilibrio con il diossido di carbonio. Questi ultimi due invece riflettono l attività mitocondriale della cellula. Metabolismo e carbonio 13

37 . Fonte: Metabolic Imaging by Hyperpolarized 13 C Magnetic Resonance Imaging for in vivo Tumor Diagnosis. Da il [1-13 C]piruvato iniettato si creano ulteriori metaboliti come [1-13 C]lattato, [1-13 C]alanina e [1-13 C]bicarbonato. Metabolismo della cellula

38 13C- pyruvate 13C- alanine 13C- lactate 13Cbicarbonate Spettro 13 C cuore

39 Le concentrazioni di piruvato, alanina, lattato e bicarbonato potessero essere indici univoci di presenza di infarto in cellule del miocardio. Ad esempio l assenza di alanina e lattato all interno delle cellule miocardiche indicano la presenza di gravi danni cellulari, come avviene nel caso di ischemie, o addirittura la morte delle stesse cellule, nel caso di infarto Applicazioni cliniche