Centro di Procreazione Medicalmente Assistita. Diagnostica e Terapia in Laboratorio. Dr. Giovanni Bracchitta

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1 Centro di Procreazione Medicalmente Assistita Diagnostica e Terapia in Laboratorio Dr. Giovanni Bracchitta

2 Ruolo del laboratorio di Fisiopatologia della Riproduzione nella diagnosi e terapia dell infertilit infertilità di coppia Diagnostica Specialistica P.M.A. di I livello (slow tech) I.V.F. II e III livello (High Tech)

3 Diagnostica Specialistica Spermiogramma di I livello L esame seminale non è un analisi con una lista di variabili, ma un insieme di variabili che vanno lette in maniera assolutamente integrata. esame chimico fisico concentrazione nemaspermica motilità nemaspermica vitalità nemaspermica morfologia nemaspermica longevità nemaspermica

4 Diagnostica Specialistica Liquido seminale (fluido biologico) Frazione liquida: plasma seminale Frazione corpuscolata componente nemaspermica componente non nemaspermica

5 Plasma seminale Secreto prostatico: Diagnostica Specialistica 15% - 30% dell eiaculato, biancastro, ph acido Ac. citrico, Zn, γ glutamiltranspeptidasi, fosfatasi acida. Secreto vescicolare: 50-80% dell eiaculato, giallastro, ph basico, vischioso Fruttosio, prostaglandine Secreto epididimario: Funzione di trasporto L - Carnitina, glicerosforil colina, alfa glucosidasi neutra

6 Macroscopiche: Diagnostica Specialistica Valutazioni caratteristiche reologiche dell eiaculato. Microscopiche: caratteristiche degli spermatozoi, caratteristiche delle cellule germinali immature caratteristiche delle cellule non nemaspermiche

7 Caratteristiche reologiche Aspetto: - normale (grigio opalescente) - acquoso (trasparente) - ematico (rossastro) - lattescente (biancastro) - pioide (giallastro pazienti con ittero assunzione di vitamine) Coagulazione: fisiologica, avviene ad opera di enzimi provenienti Liquefazione: dalle vescicole seminali (vesciculasi). - regolare: se completa dopo 10-60, ad opera di enzimi prostatici. - irregolare: se presenta zone di mancata fluidificazione. Viscosità: Diagnostica Specialistica - normale: il liquido si stacca goccia dopo goccia. - aumentata: si crea continuità tra le gocce > 2 cm = filanza. - diminuita: il liquido appare diluito, correla con l aspetto acquoso.

8 Diagnostica Specialistica Volume: normale > 2 ml ph: normale > 7.2 < 7 = si associa a patologia ostruttiva o a ipotrofie congenite o acquisite delle vescicole seminali. > 8 = si associa a flogosi.

9 Valutazione componente cellulare nemaspermica Concentrazione: normale > 20 milioni/ml Numero totale: normale > 40 milioni Motilità: sommatoria di un movimento oscillatorio lungo l asse ideale che passa per il centro della testa e uno rotatorio attorno a questo asse. A = rapida progressiva ( > 40 µm/sec ) B = lenta progressiva C = discinetica D = immobili Diagnostica Specialistica Normale: A + B > 50% A > 25%

10 Diagnostica Specialistica Morfologia: il maschio umano, insieme a qualche primato è l unico tra i mammiferi ad avere un grado così elevato di eterogeneità e pleiomorfismo dei suoi gameti. Normalità: > 30% di forme normali

11 Diagnostica Specialistica Anomalie della testa: Acefalia Macrocefalia Microcefalia Amorfa A punta

12 Diagnostica Specialistica Anomalie della testa: Piriforme Vacuolata A palla Doppia Nucleo decondensato Acrosoma ridotto

13 Diagnostica Specialistica Anomalie del collo: Angolato Spesso Inserzione asimmetrica Residuo citoplasmatico

14 Diagnostica Specialistica Anomalie della coda: Angolata Mozza Rigonfia Doppia Assente Arrotolata

15 Diagnostica Specialistica Cellule germinali immature: Spermatogoni (rari) Spermatociti I Spermatociti II (rari) Spermatidi Normali: < 10% popolazione nemaspermica

16 Diagnostica Specialistica Componente non nemaspermica: Leucociti < 1 milione/ml Emazie Cellule epiteliali Elemento tetranucleato (linea germinale)

17 Vitalità: : > 50% vivi Diagnostica Specialistica Agglutinazioni non specifiche ed aggregati

18 Valori normali? Riferimento Unità WHO 1987 WHO 1992 WHO 1999 Volume ml ph > 7.2 Concentrazione mil/ml Spz Totali mil/eiac Motilità % classe a Motilità % classe a+b WHO 2001 Morfologia % normali (?) 15 Vitalità % dei vivi < 1.0 Leucociti mil/ml < 1.0 < 1.0 < 1.0 Immunobead % spz - sfere < < 50 < 50 Mar test % spz - emz < 10 < 10 < 50 < 50

19 Anamnesi: Professione: Astinenza: Volume: ph: Fluidificazione: Viscosità: Filanza: Odore: Agglomerati: Agglutinazioni: Cellule epiteliali: Batteri: Tricomonas: Eritrociti: Valutazione post liquefazione a 60 Numero di spermatozoi totali: Numero di spermatozoi totali per eiaculato: Numero spermatozoi mobili progressivi: Numero spermatozoi mobili progressivi per eiaculato: Cellule germinali immature: Leucociti: Valutazione motilità a 35 C % Spermatozoi Immobili Mobili totali Mobili progressivi Motilità tipo: D A +B + C A + B 1^ ora 2^ ora 4^ ora Vitalità: eosina test - swelling test Morfologia: % normali %anormali - Anomalie testa % - collo % - coda % Conclusioni:

20 Terminologia delle principali alterazioni seminali Normozoospermia: Oligozoospermia: Astenozoospermia: Teratozoospermia: Oligoastenoterato Azoospermia: Aspermia: eiaculato normale concentr. Spz inferiore ai parametri di rif. motilità inferiore ai valori di riferimento morfologia inferiore ai valori di riferimento alterazione di tutte le tre variabili assenza di spermatozoi nell eiaculato assenza di eiaculato

21 Immunologia Diagnostica Specialistica Gli spz. sono altamente antigenici e normalmente isolati tramite la barriera ematotesticolare. L interruzione di questa barriera anatomica e funzionale nei tubuli seminiferi può portare alla formazione di anticorpi. Mar test (IgG) Spermar test screening ( IgG ) IBT diretto ( IgA IgG)

22 Diagnostica Specialistica Biochimica del plasma seminale ( presenza, assenza, disfunzione e infezione delle ghiandole accessorie) Markers prostatici Fosfatasi acida Acido citrico Zinco Markers epididimari alfa glucosidasi neutra carnitina Markers vescicolari Fruttosio

23 Diagnostica Specialistica Volume ph Aspetto Spz Marker Vescicolare (Fruttosio) Marker Prostatici (Acido Citrico) Marker Epididimari (Carnitina) Azoospermia secretoria Normale Normale Trasparente Assenti Normale Normale Normale Ostruzione bilaterale dei dotti deferenti Normale Normale Trasparente Assenti Normale Normale Ridotti (di origine prostatica) Ostruzione o agenesia bilaterale dei dotti eiaculatori Ridotto Acido Lattescente Assenti Ridotti o Assenti Aumentati Ridotti Ostruzione bilaterale epididimaria Normale Normale Trasparente Assente Normale Normale Normale (testa) Ridotti (coda) Ostruzione dei dotti prostatici (rara) Ridotto Alcalino Giallastro Presenti Normale Assente o Ridotto Normale

24 Interazione muco - seme Diagnostica Specialistica Studio del muco cervicale Quantità, viscosità, cellularità, filanza, cristallizzazione, ph indicazioni circa la capacità di favorire la penetrazione degli spz Post coital test (test di Sims-Huhnner) (in vivo) - n di spz attivi nel muco, motilità, sopravvivenza Slide test (test di Kurzrok e Miller) (in vitro)

25 Diagnostica Specialistica Studio di funzione nemaspermica Test di decondensazione cromatinica Test di condensazione nucleare (blu di anilina) Test di eterogeneita cromatinica (arancio di acridina) Test di capacitazione e R.A. Studio dell integrità di membrana LPO-p Status metabolico (dosaggio dell ATP) correlano con la fertilizzazione

26 Spermiogrammi I Livello Pazienti esaminati: n n Normali 21% Anormali 79%

27 Normalità in Seminologia 100% 50% - 2DS N +2DS I parametri WHO sono stati ottenuti mediante ampia rilevazione epidemiologica, essi indicano, non una normalità,, ma il limite inferiore probabilistico, al di sopra del quale un u individuo cade nella popolazione dei fertili. Le caratteristiche seminali, definibili come normali in senso gaussiano,, si discostano di molto dal minimo necessario per fecondare.

28 ,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Età pazienti Età %

29 Età pazienti % 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 50% Età

30 Spermiogrammi I Livello range età % 76% Normali Anormali

31 Pazienti che non hanno eseguito mai un esame seminale range anni 33% Si No 67%

32 Alta incidenza del fattore maschile Si deduce: Innalzamento dell età in cui si decide di volere il primo figlio Ritardo nell acquisizione di informazioni circa la propria condizione di capacità riproduttiva Si conclude: Un corretto iter diagnostico riduce alle coppie i tempi di attesa per una risposta concreta

33 Metodiche slow tech Inseminazione intrauterina (IUI) (selezione nemaspermica e pre-capacitazione) Valutazione Basale del seme: Almeno 10 milioni Spz totali 50% dotati di motilità rapida progressiva 30% dotati di morfologia normale Valutazione Post-Trattamento Volume: 0,1 0,5 ml 2-5 milioni di Spz con motilità rapida progressiva.

34 I.V.F. classica Metodiche High Tech Riproduce in vitro le condizioni fisiologiche della fecondazione e dello sviluppo embrionale Parametri Seminali Minimi richiesti per I.V.F. (dopo trattamento) > 1,5 milioni di spermatozoi mobili > 30 % normoconformati

35 Metodiche High Tech I.C.S.I. (intra cytoplasmatic sperm injection) Questa tecnica permette di iniettare un solo spz all interno dell ovocita. % di fertilizzazione ovocitaria 50 70% Il rischio di danneggiare irrimediabilmente l ovocità è del 5%

36 INDICAZIONI ALLE DIFFERENTI TECNICHE DI PMA IN FUNZIONE DELLA QUALITA SEMINALE IUI NORMOZOOSPERMIA MODERATA DISPERMIA GIFT IVF ICSI SEVERA OAT < ASSENZA FERTIL. FIVET AZOOSPERMIE VARIE ACINESIA STERILITA IMMUN. SPZ CRIOCONSERVATI ANOMAL. ULTRASTRUTTURALI

37 Stadi I.V.F. Day 0 Recupero ovocitario Produzione seme Preincubazione Preincubazione Valutazione Trattamento Insemination medium No Glucosio Fosfati AA non essenziali Glutammina Inseminazione (FIVET ICSI)

38 Stadi I.V.F. Day 1 Osservazione avvenuta fecondazione ore dall inseminazione Transfer Crioconservazione Sviluppo embrionale

39 Stadi I.V.F. Day 2 EMBRIONE A 4 CELLULE

40 Stadi I.V.F. Day 3 EMBRIONE A 8 CELLULE Cleavage medium Glucosio AA essenziali AA non essenziali Piruvato vitamine EDTA Stadi I.V.F. Day 5-65 BLASTOCISTI

41 Metodiche High Tech Microchirurgia embrionale Biopsia per diagnosi preimpianto

42 Pitting Metodiche High Tech Microchirurgia embrionale

43 Assisted Hatching Metodiche High Tech Eccessivo spessore della zona pellucida (> 15 micron) Mancato impianto a seguito di transfer ripetuti Alto grado di frammentazione degli embrioni Lento timing di segmentazione Età della paziente > 38 anni Transfer da scongelamento

44 Metodiche High Tech M.E.S.A. (Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration) Azoospermia ostruttiva Te.S.E. (Testicolar Sperm Extration) Ridotta produzione di spz da parte del testicolo Te.S.A. (Testicolar Sperm Aspiration) Crioconservazione

45 Nostra casistica Anno 2002 Cicli PMA completati Gravidanze cliniche Gravidanze on - going N %

46 Nostra casistica Anno 2002 Timing N % Ovociti prelevati Day Zigoti 2 pn Day ,5 Embryo (6-8 cell) Day

47 Grazie per l attenzionel