HPV metodiche molecolari e considerazioni su una casistica omogenea

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1 XIX Corso Nazionale per Tecnici di Laboratorio Biomedico Riccione, maggio 2012 HPV metodiche molecolari e considerazioni su una casistica omogenea Dott. Filippo Micheli

2 HPV I Papillomavirus sono classificati nella famiglia papillomaviridae di cui sono noti oltre 120 tipi. Tra questi oltre 80 infettano l uomo (HPV) e circa 1/5 sono associati ad un ampio spettro di patologie del tratto anogenitale.

3 HPV Gli HPV sono piccoli virus nudi a simmetria icosaedrica con DNA circolare a doppia elica di circa 8000 paia di basi racchiuse in un capside proteico.

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6 HPV L HPV è il virus a trasmissione sessuale più diffuso al mondo. E diffuso nel 75% della popolazione femminile sessualmente attiva. Fortunatamente nel 70% dei casi l infezione guarisce spontaneamente.

7 HPV Tuttavia la quasi totalità (oltre il 98%) dei tumori maligni del collo dell'utero sono causati dall'hpv. Possiamo distinguere i ceppi virali in base al loro potenziale oncogeno, gli HPV sono convenzionalmente suddivisi in 2 gruppi:

8 HPV HPV a basso rischio oncogenico, più frequentemente associati a lesioni vegetative benigne (condilomi):hpv 6,11, 44,53,55,26,32,42,61,62,81,84, 64, 34, 73, 66,67,69,70,40,57; a alto rischio, identificati in più dell 80% dei carcinomi della cervice:hpv16 (nel 50%),18, 31, 33,45.

9 HPV Il metodo più utilizzato per la rilevazione di lesioni HPV correlate rimane il Paptest. Negli ultimi anni è possibile affiancare al normale test di screening con metodiche di biologia molecolare.

10 La biologia molecolare ci consente di individuare la presenza del DNA virale e di discriminare sierotipi ad alto e basso grado. Una delle metodiche di elezione per questo tipo di indagine è l Hibrid Capture II.

11 Hybrid Capture II E un test di ibridazione del DNA virale con sonde ad RNA specifiche per la rilevazione qualitativa di 18 tipi di DNA virale a basso ed alto rischio in campioni cervicali.

12 HC2: Percorso tecnico La metodica consta di 5 fasi principali: - Rilascio e denaturazione degli acidi nucleici. - Ibridazione della sonda dell RNA con il DNA bersaglio - Cattura degli ibridi RNA-DNA in una fase solida - Reazione degli ibridi catturati con anticorpi coniugati multipli - Rilevamento del segnale chemiluminescente amplificato.

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14 HC2: Campioni Campioni prelevati utilizzando un dispositivo a spazzola o a spazzolino/spatola e posti in soluzione PreservCyt. Campioni prelevati con tampone cervicale DNAPap o Hc Cervical Sampler. Biopsie prelevate in Specimen Transport Medium (STM)

15 Campioni in PreservCyt Questa tipologia di campioni ci permette di eseguire sia la diagnosi citologica che l HC2 del DNA. Dopo la preparazione dei vetrini il rimanente volume del campione viene utilizzato per eseguire il test.

16 DENATURAZIONE

17 Denaturazione Lisi delle pareti cellulari con conseguente rilascio del DNA. L eventuale DNA virale presente nei campioni subisce un processo di denaturazione ovvero di apertura dei due filamenti. Tale processo avviene a 65 tramite aggiunta di agente denaturante

18 IBRIDAZIONE

19 Ibridazione L ibridazione è un processo di accoppiamento di basi tra polinucleotidi complementari a singolo filamento, provenienti da fonti diverse. Nell HC2 si usa un miscela di sonde di RNA a singolo filamento di lunghezza circa uguale all intero DNA virale bersaglio Formano ibridi stabili DNA-RNA

20 Si utilizza una piastra di ibridazione

21 Incubare la piastra in un riscaldatore di micropiastre preriscaldato a 65 C per 60minuti

22 Ibridazione A questa temperatura gli RNA presenti nella sonda e l eventuale DNA virale denaturato presente nel campione reagiscono e vanno a formare ibridi RNA/DNA. L ibrido RNA-DNA è più stabile di quello DNA-DNA permettendo l ibridazione a una temperatura più alta.

23 Cattura degli ibridi in una fase solida

24 Piastra di cattura La micropiastra di cattura è rivestita di anticorpi anti-ibridi RNA/DNA. In questa fase gli anticorpi di cui è rivestita la piastra trattengono gli ibridi RNA/DNA. la micropiastra di cattura viene fatta agitare sull agitatore rotante impostato a 1100 giri per 60 minuti.

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26 Amplificazione e rilevazione del segnale

27 Amplificazione Vengono ora applicati ai campioni anticorpi coniugati con la fosfatasi alcalina anti-ibridi RNA/DNA in soluzione tamponata. Anticorpi coniugati ognuno con molte molecole di fosfatasi alcalina riconoscono brevi sequenze dell ibrido in modo che migliaia di anticorpi possono legarsi ad ogni singolo ibrido, provocando amplificazione del segnale L amplificazione risultante è circa di 3000 volte

28 Rivelazione Si applica ora un substrato chemiluminescente. Il cromogeno viene scisso dalla fosfatasi alcalina legata, si verifica l emissione di luce, misurata da un luminometro e quantificata in unità di luce relativa(rlu). L intensità di luce emessa indica la presenza o l assenza di DNA bersaglio nel campione.

29 Calibrazione test e Interpretazione risultati

30 Calibratori e controlli di qualità Devono essere utilizzati ad ogni corsa di HC-II Servono a verificare che la metodica funzioni correttamente permettendo una determinazione precisa del valore soglia del test. Contengono al loro interno DNA virale di ceppi noti a concentrazione nota.

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32 Interpretazione risultati Calibratore negativo: deve essere analizzato in 3 replicati ad ogni dosaggio di test. RLU: >10 e < 250 i valori del calibratore devono rientrare in questo range. Tra di loro i 3 replicati devono presentare un coefficiente di variazione (%CV) < 25% se queste condizioni non si verificano la metodica non è valida.

33 Interpretazione risultati Calibratore positivo(hrc): devono essere analizzati in 3 replicati ad ogni dosaggio di test. I risultati del calibratore devono mostrare un coefficiente di variazione (%CV) < 15% La media dei 3 valori di RLU del calibratore positivo determina il Valore soglia del dosaggio.

34 Interpretazione risultati Controlli di qualità: devono essere inclusi in ogni ciclo di test e i valori di RLU/Valore soglia di ogni controllo di qualità devono rientrare nei seguenti intervalli accettabili affinchè il test possa essere considerato valido: QC1-LR: > 0,999 QC2-HR: 2 > 8

35 Interpretazione risultati RLU/Valore soglia < 1 test negativo RLU/Valore soglia > 1 test positivo

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37 NOSTRA ESPERIENZA Materiali e Metodi Dai Files dell U.O.C. di Anatomia Patologica e Citologia Diagnostica dell AORN Dei Colli di Napoli sono stati selezionati 90 casi di citologia del tratto cervico-vaginale eseguiti con la metodica dello strato sottile (Thin prep), pervenuti alla nostra osservazione a partire da gennaio 2005 al gennaio 2010 in pazienti HIV sieropositive. Età media di 34,6 anni (range 18-49). Nessuna delle pazienti era stata sottoposta precedentemente a ricerca HPV-DNA ad alto rischio oncogeno e/o ad esame colposocopico

38 NOSTRA ESPESRIENZA Popolazione di controllo: 96 donne HIV sieronegative, stessa fascia di età, stessa area geografica della popolazione HIV sieropositiva Sono state effettuate correlazioni clinicopatologiche (es. stato della malattia HIVcorrelata e frequenza dell infezione) e soprattutto tra i dati clinici e morfologici ed i risultati di biologia molecolare

39 NOSTRA ESPERIENZA MATERIALI E METODI Hybrid Capture II (HC IIE) in tutti i casi studiati per la ricerca del DNA di HPV ad alto rischio oncogenico anche nei casi morfologicamente negativi. In tutti i casi positivi al HPV-DNA ad alto rischio abbiamo studiato l a contemporanea espressione della proteina p16 e KI67 (direttamente correlat1 all azione di E7) e Rb/ 130 mediante metodiche di IHC (CINtec PLUS). Le pazienti con citologia positiva o dubbia sono state sottoposte ed esame colposcopio con relativa biopsia.

40 Risultati

41 90 casi donne HIV-sieropositive: citologia positiva in 54 casi (60%):, ASCUS in 16 casi (25%)

42 LSIL in 25 casi (39,06%)

43 HSIL in 13 casi (20.3%)

44 CITOLOGIA NEGATIVA ASCUS LSIL HSIL (90) HIVsieropositive HIVsieronegative (96) 36(33,7%) 16(25%) 25(39%) 13(20,3) 85 (88,5%) 5 (5,25%) 6 (6,25%) 0

45 Nelle pazienti sieropositive tutti i casi di ASCUS progredirono a LSIL ad un anno dal primo pap-test e 9 di LSIL progredirono ad HSIL nello stesso arco temporale.

46 Hybrid Capture II HPV- DNA ad alto rischio positivo in 5 casi (31,25%) della popolazione di donne HIVpositive con citologia negativa o dubbia (ASCUS) e in 19 casi (47,3%) delle donne HIVpositive con citologia positiva (LSIL e HSIL). Popolazione di controllo: HPV-DNA ad alto rischio è risultata in 1 casi di citologia negativa e 2 casi di quelli con citologia positiva o dubbia (LSIL e ASCUS).

47 L espressione di Rb/p130 è risultata prevalentemente citoplasmatica (delocalizzata, non nucleare) in tutti i casi positivi all esame morfologico e positivi per HPV-DNA ad alto rischio

48 RB/p130 DISPLASIA DI BASSO GRADO HPV alto grado positivo

49 p16 è risultata positiva (over-espressa) in 2 (40,0%) dei 5 casi positivi all HPV-DNA ad alto rischio di donne HIV-positive con citologia negativa o dubbia

50 CINtec PLUS DISPLASIA DI ALTO GRADO p16

51 L esame istologico dei casi positivi all HPV- DNA ad alto rischio ha confermato tutti i casi di Low Sil ed High Sil (CIN I-II e CIN III)

52 DISPLASIA DI ALTO GRADO CON HPV

53 L espressione della proteina p16 e di Rb/p130 è stata confermata nei casi istologici positivi all all HPV- DNA ad alto rischio.

54 RB/p130 DISPLASIA DI BASSO GRADO HPV alto grado positivo

55 Conclusioni La ridotta espressione nucleare e l espressione citoplasmatica di Rb/p130 è risultata direttamente correlata all iperespressione di p16 nei casi positivi per HPV-DNA ad alto rischio oncogenico. Tali dati sono stati confermati dalla espressione della proteina p16 Rb/p130 campioni istologici. Concludendo possiamo dire che lo studio immunoistochimico di Rb/p130 e p16 combinato alla metodica Hybrid Capture II (HC II) per la ricerca del DNA di HPV ad alto rischio oncogenico puo dare importanti indicazioni biologiche e molecolari riguardo al comportamento di lesioni di basso e di alto grado in donne con infezione da HIV.

56 Ringraziamenti Coordinatore tecnico: Francesco Russo Tecnici: Claudio Meleca,Renato Colonna,Vincenzo Iovino,Giovanni Guida,Fulvio Guida,Salvatore Rosati,Pasqua Colonna,Angela Messina,Giuseppe Salatiello,Ciro Abate,Marina Misuraca. Medici e Biologi: Pasquale Somma,Nicolina De rosa,ilaria De rosa,giuseppe Antinolfi,Paolo Delle donne,enrica Barra,Rosabruna Arduini