Corso di insegnamento Biochimica e Biotecnologie degli Alimenti. Spettrofotometria. Lezione n. XXII

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1 Corso di insegnamento Biochimica e Biotecnologie degli Alimenti Spettrofotometria Lezione n. XXII

2 RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE Le radiazioni elettromagnetiche possono essere rappresentate sia come un onda elettromagnetica (natura ondulatoria) che come una serie di pacchetti discreti di energia, i fotoni (natura corpuscolare). Le due rappresentazioni (onda e corpuscolo) non sono in contrasto, ma sono piuttosto due diversi aspetti di una stessa realtà. Dal punto di vista ondulatorio, le radiazioni (o onde) elettromagnetiche consistono in una forma di energia che si propaga, anche nel vuoto: sono la simultanea propagazione nello spazio delle oscillazioni di un campo elettrico e di un campo magnetico. elettrico

3 Ogni radiazione, o onda elettromagnetica, è caratterizzata dai parametri: (ni) (lambda) La frequenza è una grandezza costante per ogni radiazione n l Frequenza e lunghezza d'onda sono INVERSAMENTE PROPORZIONALI:

4 Energia di una radiazione elettromagnetica Secondo la teoria corpuscolare, una radiazione elettromagnetica consiste in 'pacchetti discreti' di energia, chiamati FOTONI, la cui ENERGIA dipende dalla frequenza, secondo l'equazione: E = h. n = h. c λ Dove h indica la costante di Planck ( = 6,63 x J. s) c= velocità della luce n = frequenza l= lunghezza d onda Quindi: i) Energia e Frequenza sono direttamente PROPORZIONALI; ii) l energia aumenta con il diminuire della lunghezza d onda;

5 I diversi tipi di radiazione elettromagnetica Esistono quindi vari tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per la loro lunghezza d'onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia). Spettro delle radiazioni elettromagnetiche:

6 La luce visibile La radiazione visibile rappresenta solo una piccola parte dello spettro elettromagnetico: E = h. n = h. c λ Alle diverse radiazioni visibili, che differiscono per la loro lunghezza d'onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia) corrispondono i diversi colori.

7 Luce monocromatica e policromatica Un raggio di luce bianca che colpisce un prisma di vetro viene scomposto in diversi colori. La scomposizione ('dispersione') in diversi colori della luce bianca attraverso un prisma avviene perché: i) la luce bianca è in realtà un miscuglio di radiazioni di diversa frequenza e quindi corrispondenti a tutti i colori; ii) ii) quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro, viene deviato (fenomeno detto rifrazione ): l'entità della deviazione dipende dalla lunghezza d'onda del raggio incidente. Una radiazione di un solo colore ottenuta tramite dispersione, caratterizzata da una sola frequenza e lunghezza d'onda, viene detta MONOCROMATICA. Si parla invece di fascio di luce POLICROMATICA quando esso è costituito da radiazioni di frequenza e lunghezza d'onda diverse. La luce bianca proveniente dal sole è dunque policromatica.

8 Analisi qualitativa e quantitativa L'analisi spettrofotometrica consiste nella misurazione di radiazioni elettromagnetiche emesse o assorbite delle sostanze in esame. Poiché ogni sostanza assorbe o emette radiazioni di lunghezza d'onda caratteristica, l analisi spettrofotometrica è in grado di fornire informazioni sia qualitative che quantitative: - L'analisi dello spettro permette di individuare la natura della sostanza in esame; - La misura dell'intensità delle radiazioni emesse o assorbite permette di risalire alla quantità di sostanza analizzata.

9 assorbimento emissione PRINCIPIO TEORICO- INTERAZIONE MATERIA-RADIAZIONI Quando atomi o molecole sono colpite da radiazioni, gli elettroni possono assorbire quantità definite e caratteristiche di energia e passare a stati energetici più alti. S + Energia S* Stato fondamentale Stato eccitato Su questo principio si basano sia la spettroscopia di assorbimento sia quella di emissione. Spettroscopia di ASSORBIMENTO (spettrofotometria e colorimetria) Quando atomi o molecole vengono eccitati da opportune radiazioni elettromagnetiche ( hν ), passando a stati energetici maggiori, si ha il fenomeno di ASSORBIMENTO S + hn S* Spettroscopia di EMISSIONE (fluorimetria e fosforimetria) Dagli stati eccitati, ritornando allo stato fondamentale, gli atomi e le molecole emettono energia sotto forma di radiazioni elettromagnetiche ( hn ) e così si ha il fenomeno di EMISSIONE S* S + hn

10 LE APPLICAZIONI ANALITICHE La lunghezza d'onda delle radiazioni assorbite sono caratteristiche delle varie sostanze: ciò consente di effettuare analisi QUALITATIVE L'intensità delle radiazioni assorbite dipendono dalla quantità di sostanza: ciò consente di effettuare analisi QUANTITATIVE

11 SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO La spettroscopia di assorbimento permette, attraverso lo studio delle radiazioni assorbite e dell'intensità dell'assorbimento delle varie sostanze, di effettuare rapide e precise analisi sia qualitative sia quantitative. Spettroscopia nel visibile e nell'ultravioletto Sfrutta le transizioni fra diversi stati elettronici della molecola. Le sostanze organiche contengono nella molecola legami prevalentemente di tipo covalente, formati cioè da coppie di elettroni in comune tra i vari atomi. Esistono elettroni di legame: di tipo sigma ( ), costituiti da una nube elettronica addensata lungo l'asse di unione dei nuclei degli atomi interessati al legame (i legami semplici sono di tipo ); di tipo pi-greco ( ), costituiti da coppie di elettroni la cui maggior densità elettronica è situata al di fuori dell'asse di unione dei nuclei (come accade nei legami doppi o tripli).

12 Gli elettroni sono 'meno legati' e risultano perciò più facilmente eccitabili rispetto ai. Se poi in un molecola sono presenti doppi legami coniugati, si verifica una delocalizzazione elettronica con conseguente diminuzione energetica tra un livello e l'altro: per effettuare transizioni occorreranno quindi radiazioni di minor energia, quali ad esempio quelle nel campo visibile. Oltre che nel caso di sostanze organiche con sistemi di doppi legami coniugati, si osservano eccitazioni nell'ambito del visibile in diversi composti e complessi di metalli di transizione (es.: CuSO4. 5H2O).

13 ASSORBIMENTO NELL UV/VISIBILE L'eccitazione degli elettroni di valenza di una molecola richiede energie tanto più elevate quanto più grande è la separazione fra i livelli elettronici di partenza e di arrivo delle transizioni. Le più comuni transizioni energetiche e le corrispondenti lunghezze d'onda sono: transizioni σ σ* ( nm circa); transizioni π π* e n σ* ( nm circa); transizioni n π* (da 285 nm circa in su). Queste transizioni sono caratteristiche sia dei composti organici sia dei composti inorganici che possiedono elettroni di valenza di tipo σ π Nei composti inorganici e metallorganici che possiedono anche elettroni di tipo d (e f), sono possibili transizioni d d (e f f).

14 Transizioni π π* e n σ* ( nm circa); Il benzene mostra tre bande: a 184 nm (ε= mol -1 cm -1 ), 204 nm (ε= 7900 mol -1 cm -1 ) e 256 nm (ε= 200 mol -1 cm -1 ). Shift batocromico: Spostamento di l a valori più elevati Come si può comprendere dai valori delle intensità solo la prima banda è dovuta a transizioni permesse; la seconda e ancor più la terza, che è tipica del benzene (detta anche banda B) sono proibite dalle regole di simmetria e quindi sono di modesta intensità. Per il benzene si possono avere notevoli effetti batocromici a causa di sostituenti sull anello: tale effetto sarà tanto maggiore quanto più il sostituente ha possibilità di far interagire i suoi orbitali con quelli del nucleo benzenico. Si avrà inoltre un effetto ipercromico notevole se il sostituente è un gruppo auxocromo. Nel caso dell anello benzenico c è infatti la possibilità di trasferimento elettronico tra anello e sostituente per esempio nei derivati carbonilici o nitro o, viceversa quando il sostituente ha doppietti elettronici disponibili come i gruppi OH, -OR, -NH 2, -NR 2.

15 Per quanto attiene il gruppo carbonilico le bande di assorbimento sono due. La prima, dovuta a una transizione di tipo n π* è caratterizzata da un intensità molto bassa e cade a circa 280 nm. La seconda è dovuta a una transizione del tipo π π * e cade a una lunghezza d onda minore.

16 Assorbimento dei composti organici Consideriamo le principali transizioni energetiche: Transizioni σ σ*. Corrispondono alla rottura di legami e quindi richiedono energie molto elevate. Gli alcani, le cui molecole contengono solo legami C-C e C-H, danno solo questi assorbimenti che cadono nella regione dell'uv lontano, detta anche UV sotto vuoto. Transizioni π π*. Sono tipiche dei composti insaturi e comprendono: la transizione E (o etilenica) di sistemi π isolati; la transizione B (o benzenoide) di anelli benzenici. La banda può avere una struttura anche complessa, ma non è molto intensa perché è proibita dalle regole di selezione. la transizione K (o di coniugazione) di sistemi aromatici o coniugati. Tanto più è estesa la delocalizzazione, tanto maggiore è la lunghezza d'onda dell'assorbimento e l'intensità della banda.

17 Transizioni n σ* o n π*. Sono transizioni di tipo R (o radicalico) che coinvolgono eteroatomi con doppietti di non legame come l'ossigeno di C=O (gruppo carbonilico) e C-O (alcoli), o l'azoto di C=N, C-N (ammine) e N=N, o lo zolfo di C-S (tioli). Le bande R non sono intense perche queste transizioni sono proibite dalle regole di selezione. Transizioni per trasferimento di carica. Sono dovute a veri e propri spostamenti di elettroni da una parte all'altra della molecola e di solito forniscono le bande piu intense dello spettro. I composti aromatici sostituiti presentano bande di questo tipo che cadono nell'intervallo nm.

18 Spettroscopia UV: definizioni Cromoforo: la parte della molecola responsabile dell'assorbimento UV (per esempio, un carbonile α,β insaturo; un gruppo aromatico) Gruppo auxocromo: Un gruppo che non è di per sé un cromoforo, ma può modificare l'intensità e la lunghezza d'onda di assorbimento di un cromoforo (i gruppi con doppietti di non legame come OH; -NH2 sono tipici auxocromi) Shift batocromico: Consiste nello spostamento a lunghezze d onda più alte (verso il rosso) della lmax. Tale effetto dipende dalla presenza di gruppi funzionali, detti appunto batocromi, nelle adiacenze del cromoforo, come può essere un doppio legame in α a un carbonile. Shift ipsocromico: Consiste nello spostamento a lunghezze d onda più basse (verso il blu) della l max. Tale effetto dipende dalla presenza di gruppi funzionali, detti appunto ipsocromi, nelle adiacenze del cromoforo, che ne diminuiscono la delocalizzazione elettronica. Classico è il caso dell anilina in ambiente acido, dove è presente come ione anilinio (anche se questo è più giusto dirlo effetto ph). Effetto ipercromico: Aumento dell'ε della transizione Effetto ipocromico: Diminuzione dell'ε della transizione

19 Assorbimento UV dei composti organici Alcani Hanno solo legami e non hanno coppie di elettroni di non legame. Per questa ragione sono trasparenti all UV a tutte le lunghezze d onde Composti saturi contenenti eteroatomi Questi composti (alcoli, eteri, ammine, tioli, solfuri) possono avere transizioni n, di energia minore rispetto alle. Tuttavia questi assorbimenti cadono ancora nel lontano UV, o al limite intorno ai 200nm, per cui sono di scarsa utilità pratica. Alcheni Gli alcheni isolati (cioè non coniugati) possono presentare transizioni di tipo, ma assorbono ancora nel lontano UV. Per esempio l etilene ha una l max di 175nm. Tuttavia l assorbimento di alcheni più sostituiti (con gruppi alchilici) si sposta verso lunghezze d onda più alte (shift batocromico). Anche eteroatomi direttamente legati al doppio legame possono dare notevoli shift batocromici a causa della possibilità di coniugazione. n

20 Alcheni coniugati Questi composti assorbono nel vicino UV, a lunghezze d onda tanto maggiori quanto più grande è il numero di doppi legami coinvolti nella coniugazione. H H C C H H l max 165 nm l max 217 nm H 3 C H H C C H H C C H H H C C H H C C H l max 263 nm H C C H CH 3

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22 SPETTRO di ASSORBIMENTO Lo spettro è un grafico dell intensità dell assorbimento di una radiazione elettromagnetica in funzione della sua lunghezza d onda. Generalmente lo spettro è ottenuto irradiando il campione con radiazioni monocromatiche di lunghezze d onda via via crescenti e misurando l assorbimento di ciascuna di esse. Gli apparecchi necessari a fare questo sono detti spettrometri. Uno spettrometro è formato da 5 componenti fondamentali: Sorgente Monocromatore Compartimento celle Rivelatore Registratore

23 SORGENTE È la parte dell apparecchio da cui prende origine la radiazione policromatica (contenenti cioè tutte le lunghezze d'onda del campo richiesto) che viene diretta sul campione. per la regione del visibile si utilizzano lampade a incandescenza (a filamento di tungsteno) per la regione UV si usano lampade a deuterio, costituite da un'ampolla di quarzo contenente deuterio gassoso a bassa pressione in cui viene fatta passare una scarica di corrente elettrica.

24 Monocromatore Serve a selezionare la radiazione elettromagnetica di una particolare lunghezza d onda tra tutte quelle prodotte dalla sorgente. Esso cioè «scompone» la radiazione policromatica in bande il più possibile monocromatiche. I primi monocromatori erano basati sul prisma di vetro che come è noto è in grado di scomporre la luce bianca nelle sue componenti colorate grazie al fenomeno della rifrazione: quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro subisce una deviazione di un angolo inversamente proporzionale alla l della radiazione (cioè, radiazioni con diversa λ subiscono diversa deviazione). Fenditura d uscita

25 Cella È la componente destinata a contenere il campione da esaminare. In generale la sostanza che vogliamo esaminare è sciolta in un determinato solvente e messa in un contenitore chiamato cuvetta o cella. Questo contenitore deve essere trasparente alla radiazione elettromagnetica che a noi interessa. Nella spettroscopia UV si utilizzano cuvette di quarzo. La lunghezza del tratto che la radiazione elettromagnetica percorre attraversando il campione è detta cammino ottico e dipende dalla forma e dimensioni della cuvetta. Raggio incidente Raggio emergente b

26 Rivelatore e Registratore È un dispositivo capace di generare un segnale elettrico quando è colpito da una radiazione elettromagnetica. Il segnale elettrico è proporzionale alla intensità della radiazione elettromagnetica. Il segnale in uscita dal rivelatore può essere utilizzato direttamente per tracciare uno spettro usando un registratore. In questo dispositivo il segnale del rivelatore controlla la posizione di un pennino che scrive su una striscia di carta in movimento. Tuttavia oggi gli apparecchi sono interfacciati con un computer che regola il monocromatore, registra in memoria i valori di assorbimento alle varie frequenze, elabora i dati ottenuti e li stampa su carta.

27 TIPI DI SPETTROMETRI Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come sono organizzate le varie componenti: SPETTROMETRI MONORAGGIO SPETTROMETRI A DOPPIO RAGGIO

28 Analisi quantitativa Per eseguire analisi quantitative si fa uso di raggi monocromatici, cioè costituiti da radiazioni di una sola frequenza. In pratica, date le difficoltà di avere raggi dotati di questa proprietà, si impiegano fasci di radiazioni comprendenti una banda molto ristretta dello spettro, ossia fasci quasi monocromatici. Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una radiazione attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente in funzione della concentrazione. Appositi dispositivi sono in grado di misurare l'intensità del flusso luminoso ed in particolare: I 0 : intensità del flusso luminoso all'ingresso della cella con il campione; I : intensità del flusso luminoso all'uscita della cella con il campione.

29 Dalla misura dei flussi I O e I, gli strumenti forniscono direttamente i valori di TRASMITTANZA e ASSORBANZA, che rappresentano le grandezze caratteristiche della spettroscopia di assorbimento. Il rapporto tra l'intensità del raggio uscente e quella del raggio rentrante si chiama TRASMITTANZA: T = I/I 0 Questa grandezza esprime quale frazione della luce incidente ha attraversato il campione senza essere assorbita. T può assumere valori compresi tra 0 e 1. Comunemente si usa però la TRASMITTANZA PERCENTUALE, che assumerà quindi valori compresi tra 0 e 100: T% = T x 100 T%=100 significa che il raggio non ha subito alcun indebolimento, cioè non vi è stato alcun assorbimento da parte della sostanza; T%=0 significa che il raggio è stato completate assorbito. Altra grandezza di fondamentale importanza è l' ASSORBANZA, detta anche 'densità ottica' o 'estinzione : A = - log T L'assorbanza viene utilizzata nelle analisi quantitative poiché risulta direttamente proporzionale alla concentrazione. Trasmittanza, trasmittanza percentuale e assorbanza sono adimensionali (numeri, senza unità di misura).

30 Legge dell'assorbimento (legge di Lambert-Beer) Prendendo in considerazione una cella, contenente una sostanza in soluzione, attraversata da un raggio di luce monocromatica, si dimostra che A = e x l x c dove: A = assorbanza (adimensionale) e = coefficiente di assorbimento molare, caratteristico della sostanza (mol -1 L cm -1 ) l = cammino ottico (cm), cioè lo spessore della soluzione c= concentrazione molare della sostanza (mol/l)

31 Il coefficiente di estinzione A = e x l x c Il coefficiente di estinzione molare indica l assorbanza di una soluzione 1 M della sostanza in esame quando viene letta in una cuvetta con percorso ottico uguale ad 1 cm ad una determinata lunghezza d onda. E evidente, dalla definizione data, che il coefficiente di estinzione molare si può calcolare solo se è disponibile il valore del peso molecolare. Quando però, soprattutto nel caso di macromolecole come le proteine e gli acidi nucleici, non è disponibile il peso molecolare, si fa uso di un altro parametro e cioè di E 1% cm Il coefficiente di estinzione percentuale indica l assorbimento di una soluzione all 1% della sostanza in esame, quando viene letta in una cuvetta dal percorso ottico di 1 cm. In tal caso: e = coefficiente di assorbimento molare, caratteristico della sostanza (g -1 ml cm -1 ) l = cammino ottico (cm), cioè lo spessore della soluzione c= concentrazione molare della sostanza (g/ml).

32 Scelta della lunghezza d'onda Nell'analisi quantitativa spettrofotometrica è fondamentale conoscere come varia l'assorbanza in funzione della lunghezza d'onda. Ciò può essere valutato monitorando lo spettro di ogni sostanza che presenta dei massimi caratteristici in corrispondenza di alcune lunghezze d'onda. Nota: La maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento a 280 nm, per la presenza di triptofano (W), tirosina (Y) e fenilalanina. In genere verrà scelta una lunghezza d'onda in modo che l assorbimento: sia massimo (per motivi di sensibilità: se l'assorbimento è alto è possibile rilevare quantità piccolissime di sostanza); sia al centro di un picco 'largo' (per motivi di precisione: cosicché piccole variazioni di lunghezza d'onda comportino errori minimi sulla misura dell'assorbanza) Nel caso di miscele di sostanze, la scelta, per la determinazione di una sostanza, cadrà su una lunghezza d'onda dove le altre sostanze assorbono il meno possibile.