Lezione successiva in auletta 3º piano... staremo stretti! No lezione 10 gennaio 2018

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Giorgio Bossi
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1 Lezione successiva in auletta 3º piano... staremo stretti! No lezione 10 gennaio 2018

2 Esercitazione di citogenetica: few notes

3 Storia della citogenetica 1888 Waldeyer: termine cromosoma 1889 W.Fleming: immagini di cromosomi (cromatina) 1900 Riscoperta di Mendel. Sutton e Bovery: teoria cromosomica dell ereditatarieta 1923 Painter: determinazione del sesso nell uomo: XY

4 1950 & Storia della citogenetica Studi su sezioni di testicoli (48 cromosomi) 4

5 & Storia della citogenetica 1952 Soluzione ipotonica (T.C.Hsu) (48 cromosomi)

6 & Storia della citogenetica 1955 Ford e Hamerton: colchicina 6

7 1956 & Storia della citogenetica Tijo e Levan: uso della colchicina e ipotonica: 46 cromosomi 7

8 & Storia della citogenetica 1959 Sindromi: +21; X0; XXY 1960 P.Nowell: PHA per coltura linfociti 1960 Cromosoma Philadelphia

9 & Storia della citogenetica 1966 Conferenza di Chicago gruppo A 4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C gruppo D gruppo E gruppo F Y gruppo G

10 Il bandeggio dei cromosomi Il bandeggio è definito come la variazione di proprietà di colorazione del cromosoma nella sua lunghezza. Utilizzando diverse metodiche di colorazione dei cromosomi è possibile osservare al microscopio ottico la produzione di un certo numero di bande, perfettamente riproducibili come numero, posizione ed estensione negli stessi cromosomi di cellule diverse provenienti dallo stesso individuo. (a) (b) Cariogrammi umani, colorazione Giemsa: non bandeggiato (a) o previo trattamento proteolitico (b: bande G).

11 & Storia della citogenetica 1971 Quinacrine mustard:q-banding (Caspersson)

12 1972 G-banding con Giemsa & Storia della citogenetica Bande scure - bande G, replicano tardivamente (cromatina più condensata), ricche in AT Bande chiare -Gnegative, replicano precocemente (cromatina meno condensata), ricche in GC 12

13 Metodi colorazione differenziale Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi C-bande: tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili dei cromosomi 1,9,16,Y Creano un alternanza di bande chiare e scure lungo l asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi.

14 Cariotipi a confronto Bandeggio Q Bandeggio G

15 L ideogramma dei cromosomi umani

16 Bandeggio a maggiore risoluzione

17 Terminologia 46,XX - cariotipo normale Femminile 46,XY - cariotipo normale Maschile Questo modo di scrivere ci da due informazioni: - numero totale dei cromosomi (46) - sesso dell organismo 47,XY,+21 Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu (sindrome di Down) 46,XX,del(14)(q23) del=delezione 46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione 46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello)

18 Analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

19 COLTURE CELLULARI colture di tessuto TIPI DI COLTURE CELLULARI colture di organo colture di cellule

20 Allestimento del preparato da sangue periferico sangue periferico terreno di coltura fitoemoagglutinina (stimola la crescita) proliferazione 48-96h colchicina (ultimi 30 ) centrifugazione Ipotonica (20 ) pellet risospeso Prefissaggio con aggiunta fissativo (2ml) Centrifugazione fissativo risospensione in poco fissativo allestimento del preparato centrifugazioni (2-3)

21 PREPARAZIONE DEL VETRINO Aggiunta di colchicina (in fiasca) Eliminazione del terreno di coltura Aggiunta della soluzione ipotonica (in falcon) Prefissaggio Fissaggio 21

22 OSSERVAZIONE DEL PREPARATO BANDEGGIO (La tipologia dipende dalla disponibilita del laboratorio) OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO E ACQUISIZIONE DELLE IMMAGINI (tante e buone!) ANALISI DELLE IMMAGINI 22

23 Immagine da microscopio a contrasto di fase 23

24 Colorazione QM 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine Fluorocromi: QM, DAPI. Necessario un microscopio a fluorescenza

25 Selezione delle metafasi J Ottima ma..

26 Selezione delle metafasi L Puo essere anche cosi.. M Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche da contare. Scartare! (potendo)

27 L.. O cosi Selezione delle metafasi M Troppo contratti pero si puo usare per contarli. Scartare! (potendo)

28 Selezione delle metafasi K Sufficiente M Si possono contare Puo essere utile per analizzare i cromosomi non sovrapposti 28

29 Come si fa il cariotipo? 1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO (non si conta una sola metafase!!!) 2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA 3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE

30 Fare il cariotipo

31 Cariotipo ordinato CARIOTIPO IN QM (specifico il bandeggio) Il cariotipo si puo fare anche a partire da colture cellulari, come ad esempio le colture ottenibili da materiale abortivo. Utilizzando questa strategia si possono avere informazioni sul cariotipo dell aborto...

32 Monosomia nell uomo 45; X0 Se riscontrata nei nati vivi viene anche chiamata Sindrome di Turner. Sesso femminile, amenorrea primaria, bassa statura, streak gonades 32

33 Trisomia nell uomo 47XX+15 trisomia del cromosoma 15 Incompatibile con lo sviluppo Reperto rinvenuto in un aborto spontaneo del primo trimestre 33

34 Trisomia del cromosoma 4 34

35 Trisomia del cromosoma 21 35

36 Trisomia del cromosoma 17 36

37 ANOMALIA Trisomie autosomi ABORTI SPONTANEI NATI VIVI Percentuale delle anomalie cromosomiche tra gli aborti spontanei ed i nati vivi % 0.01% % 0.00% % 0.02% % 0.11% Altre 11.81% 0.00% Totale trisomie 21.33% 1.34% Monosomie della X 0.84% 0.01% Trisomie crom. sessuali 0.33% 0.15% Triploidie 5.79% 0.00% Tetraploidie 2.39% 0.00% Totale anomalie 41.52% 0.60% Numero dei cariotipi

38 Frequenza anomalie cromosomiche numeriche 38

39 Traslocazione robertsoniana 13/21 bilanciata

distinguere sequenze che siano distanti 1-3

40 per identificare riarrangiamenti di frammenti cromosomici di dimensioni superiori a ~5 Mb WCP CARIOTIPO FISH PCP per identificare riarrangiamenti di frammenti cromosomici di dimensioni superiori a ~5 Mb BAC si possono distinguere sequenze che siano distanti 1-3 Kb

41 Inversione pericentrica nell uomo:4(inv) library 4p library 4q 46,XX inv(4)(p15q12) 41

42 Inversione pericentrica nell uomo:4(inv) BAC clones Identificando il breakpoint 46,XX inv(4)(p15q12) N.B. Sonde a monte del punto di rottura rimangono nella posizione originale, mentre a valle del punto di rottura cambiano posizione

43 Traslocazione Library crom.18 18q t(14/18) 14 t(18/14) 14q 18 46,XX t(14;18)(14pter 14q23::18q22 18qter;18pter 18q22::14q23 14qter) 43

44 FISH PER IDENTIFICARE TRASLOCAZIONI E INVERSIONI

45 Per approfondimenti corso di CITOGENETICA ED EVOLUZIONE Prof.ssa Catacchio Claudia Rita CDL Biologia (come corso a scelta per CFU a scelta) 2º semestre 45

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