SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE. University of Messina, Italy. Analitica 26 16/17

Transcript

1 27 SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE 1

2 Spettroscopia di fluorescenza molecolare La fluorescenza è un processo di fotoluminescenza, molto importante dal punto di vista analitico, in cui gli atomi o le molecole vengono eccitate mediante assorbimento di radiazione elettromagnetica. Le specie eccitate ritornano al loro stato fondamentale emettendo l energia in eccesso sotto forma di fotoni. 2

3 Vantaggi e svantaggi dei metodi di fluorescenza enorme sensibilità; da uno a tre ordini di grandezza migliore di quella offerta dalla spettroscopia di assorbimento elevato intervallo di linearità; significativamente superiore a quello della spettroscopia di assorbimento meno largamente applicabili rispetto ai metodi di assorbimento per il ridotto numero di sistemi chimici in grado di dare fluorescenza 3

4 Un esempio pratico La forma ridotta del coenzima Nicotibammide Adenin- Dinucleotide (NADH) assorbe la radiazione a 340 nm La molecola fluoresce emettendo una radiazione a 465 nm 4

5 Teoria della fluorescenza molecolare La figura è una raffigurazione schematica parziale della distribuzione di energia per una specie molecolare ipotetica. Con E 0 esprimiamo lo stato fondamentale mentre E 1 e E 2 sono gli stati elettronici eccitati. A ciascuno degli stati elettronici sono associati quattro stati eccitati vibrazionali. 5

6 Teoria della fluorescenza molecolare Nella figura (a) è evidente come l irradiazione della specie E 0 mediante una banda di radiazione di lunghezze d onda da λ 1 a λ 5 origina un momentaneo popolamento dei cinque livelli vibrazionali del primo stato eccitato E 1. 6

7 Teoria della fluorescenza molecolare Nella figura (a) è evidente come l irradiazione della specie E 0 mediante una banda di radiazione di lunghezze d onda da λ 1 a λ 5 origina un momentaneo popolamento dei cinque livelli vibrazionali del primo stato eccitato E 1. 7

8 Teoria della fluorescenza molecolare Allo stesso modo sempre sulla figura (a) si osserva che quando le molecole sono irradiate da una banda di radiazione più energetica, costituita d a lunghezze d onda più piccole da λ 1 a λ 5, risultano popolati rapidamente i cinque livelli vibrazionali dello stato energetico più elevato E 2. 8

9 Teoria della fluorescenza molecolare Il tempo di vita di una specie eccitata è molto breve poiché sono numerosi i modi con cui una molecola o un atomo eccitato può perdere l energia assorbita e rilassarsi sino al proprio stato fondamentale. Due meccanismi importanti di questo tipo di processo sono: rilassamento non-radiativo [figura(b)] rilassamento fluorescente [figura(c)] 9

10 Rilassamento non-radiativo La disattivazione vibrazionale o rilassamento è indicata in figura (b) dalle piccole frecce ondulate tra i livelli di energia vibrazionale e avviene durante le collisioni tra le molecole eccitate e le molecole del solvente. L energia vibrazionale eccedente viene trasferita alle molecole del solvente in una serie di passaggi come indicato in figura (b). La vita media di uno stato vibrazionale eccitato è solo di sec. 10

11 Rilassamento non-radiativo Talvolta può avvenire il rilassamento non-radiativo tra il livello vibrazionale più basso di uno stato elettronico eccitato e quello più alto di un altro stato elettronico. Questo processo è detto conversione interna ( vedi figura b) ed è molto meno efficiente del rilassamento vibrazionale. La vita media di uno stato elettronico eccitato è tra i 10-9 e i 10-6 sec. 11

12 Rilassamento fluorescente Come è mostrato in figura (c) quando le molecole diventano fluorescenti vengono prodotte bande di radiazioni poiché le molecole eccitate elettronicamente possono subire un processo di rilassamento verso uno qualsiasi dei numerosi stati vibrazionali dello stato elettronico fondamentale. 12

13 Linee di risonanza e spostamento di Stokes Le linee con cui terminano le due bande di fluorescenza a lunghezza d onda più piccola, o ad alta energia, (λ 1 e λ 1 ) sono identiche in energia alle due linee indicate da λ 1 e λ 1 nello schema di assorbimento della figura (a). Queste linee sono dette linee di risonanza in quanto le lunghezze d onda dell assorbimento e della fluorescenza sono identiche. 13

14 Linee di risonanza e spostamento di Stokes Le bande di fluorescenza molecolare sono costituite soprattutto da linee con lunghezze d onda maggiori, e quindi con minore energia, delle bande di radiazione assorbite responsabili del loro eccitamento. Questo spostamento verso lunghezze d onda maggiori è talvolta chiamato spostamento di Stokes. 14

15 Relazione tra gli spettri di eccitazione e gli spettri di fluorescenza Le differenze tra gli stati vibrazionali sono simili sia per lo stato fondamentale che per quelli eccitati per cui l assorbimento o spettro di eccitazione e lo spettro di fluorescenza per un composto appaiono come immagini approssimativamente speculari l uno dell altro con sovrapposizione nella linea di risonanza. Antracene in alcol 15

16 Specie fluorescenti La fluorescenza è uno dei molteplici processi per il quale una molecola ritorna allo stato fondamentale dopo che viene eccitata mediante assorbimento di radiazione. Tutte le molecole sottoposte a tale processo potenzialmente possono emettere fluorescenza. 16

17 Specie fluorescenti La maggior parte tuttavia non lo fa perché la loro struttura determina percorsi di rilassamento non-radiativi che avvengono a velocità superiori rispetto all emissione fluorescente. 17

18 Specie fluorescenti Il rendimento quantico di fluorescenza molecolare è semplicemente il rapporto tra il numero di molecole che emettono fluorescenza e il numero totale di molecole eccitate. 18

19 Specie fluorescenti Molecole altamente fluorescenti hanno efficienze quantiche che raggiungono l unità mentre specie non fluorescenti hanno valori molto prossimi allo zero. 19

20 Fluorescenza e struttura I composti contenenti anelli aromatici danno la più intensa e la più utile emissione fluorescente molecolare. I più semplici eterocicli (piridina, furano, tiofene e pirrolo) non mostrano fluorescenza molecolare mentre strutture fuse contenenti questi anelli fluorescono. 20

21 Fluorescenza e struttura Una sostituzione su un anello aromatico determina spostamenti nella lunghezza d onda dei massimi d i assorbimento e variazioni corrispondenti nei picchi di fluorescenza. La sostituzione interferisce talvolta sull efficienza della fluorescenza. 21

22 Effetto della rigidità strutturale La fluorescenza viene favorita in modo particolare dalle molecole rigide. Nell esempio riportato a fianco l efficienza quantica del fluorene è circa 1 mentre quella del bifenile è circa 0.2. La differenza di comportamento è imputabile all aumento di rigidità dovuto al ponte del gruppo metilenico nel fluorene. 22

23 Effetto della rigidità strutturale La rigidità fa diminuire la velocità di rilassamento non-radiativo sino ad un valore per cui diventa competitivo il rilassamento mediante fluorescenza. L influenza della rigidità spiega anche l aumento in fluorescenza di alcuni agenti organici chelanti quando questi sono complessati con uno ione metallico. 8-idrossichinolina Le molecole libere dell 8-idrossichinolina in soluzione vengono velocemente disattivate mediante le collisioni con le molecole del solvente e quindi non fluorescono. La rigidità del complesso Zn-8- idrossichinolina migliora la fluorescenza. Complesso con lo zinco dell 8-idrossichinolina 23

24 Temperatura ed effetti del solvente L efficienza quantica di fluorescenza decresce con l aumentare della temperatura poiché l aumento della frequenza delle collisioni a temperature elevate fa aumentare la probabilità di un rilassamento collisionale. La diminuzione della viscosità nel solvente porta agli stessi risultati. 24

25 Effetto della concentrazione sull intensità di fluorescenza L intensità della radiazione fluorescente F è proporzionale al potere radiante del raggio di eccitazione assorbito dal sistema: F = K (P 0 P) dove P 0 rappresenta il potere radiante incidente sulla soluzione e P il suo valore, dopo che il raggio ha attraversato una lunghezza b della soluzione. K dipende dall efficienza quantica di fluorescenza. Per esprimere F in funzione della concentrazione c della particella fluorescente scriviamo la legge di Beer nella forma: Sostituendo si ha P/P 0 = 10 -εbc F = K P 0 (1-10 -εbc ) Quando εbc = A < 0.05 F = Kc 25

26 Effetto della concentrazione sull intensità di fluorescenza Un diagramma della potenza fluorescente di una soluzione contro la concentrazione delle specie emettenti mostra linearità a basse concentrazioni. 26

27 Effetto della concentrazione sull intensità di fluorescenza Quando però c diventa abbastanza grande da determinare un valore di assorbanza superiore a circa 0.05( o una trasmittanza inferiore al 90%) la linearità scompare ed F si trova al di sotto della retta di estrapolazione (ASSORBIMENTO PRIMARIO). A concentrazioni molto alte, F raggiunge un massimo e può anche cominciare a diminuire con l aumentare della concentrazione a cause dell ASSORBIMENTO SECONDARIO in cui la radiazione emessa viene aasorbita da latre molecole di analita. 27

28 Effetto della concentrazione sull intensità di fluorescenza L effetto precedentemente descritto è il risultato dell autospegnimento per cui le molecole dell analita assorbono la fluorescenza prodotta dalle altre molecole dell analita stesso. In realtà, a concentrazioni molto elevate, F raggiunge un livello massimo e poi comincia a decrescere man mano che aumenta la concentrazione. 28

29 Strumenti per la misura della fluorescenza La figura a fianco mostra una tipica configurazione degli elementi che compongono i fluorimetri e gli spettrofluorimetri. 29

30 Strumenti per la misura della fluorescenza La figura a fianco mostra una tipica configurazione degli elementi che compongono i fluorimetri e gli spettrofluorimetri. 30

31 Strumenti per la misura della fluorescenza I fluorimetri, così come il fotometro, utilizzano i filtri per la selezione delle lunghezze d onda. Gli spettrofluorimetri utilizzano invece un filtro per selezionare la radiazione di eccitazione ed un monocromatore a reticolo per disperdere la radiazione fluorescente emessa dal campione. 31

32 Strumenti per la misura della fluorescenza Generalmente tutti gli strumenti per la fluorescenza sono del tipo a doppio raggio per compensare fluttuazioni nella potenza della sorgente. 32

33 Strumenti per la misura della fluorescenza Il raggio diretto verso il campione passa prima attraverso un filtro o monocromatore primario il quale trasmette le radiazioni che stimolano la fluorescenza ed esclude o limita quelle corrispondenti alle lunghezze d onda della fluorescenza. 33

34 Strumenti per la misura della fluorescenza La radiazione di fluorescenza viene emessa dal campione in tutte le direzioni ma può essere osservata in modo conveniente ad angolo retto al raggio di eccitazione; ad angoli diversi l incremento della diffusione della radiazione da parte della soluzione e dalle pareti della cella genera grossi errori nella misura dell intensità. 34

35 Strumenti per la misura della fluorescenza La radiazione emessa raggiunge un rivelatore fotoelettrico dopo essere passata attraverso il filtro, o monocromatore secondario, che isola un picco di fluorescenza per la misurazione. 35

36 Strumenti per la misura della fluorescenza Il raggio di riferimento passa attraverso un attenuatore che diminuisce la sua potenza approssimativamente fino a quella della radiazione di fluorescenza. I segnali provenienti dai fototubi del riferimento e del campione sono successivamente processati da un amplificatore la cui uscita è monitorata da un registratore. 36

37 Strumenti per la misura della fluorescenza I fluorimetri sono più sensibili degli spettrofluorimetri poiché i filtri hanno una maggiore capacità di trasmissione della radiazione rispetto ai monocromatori. La sorgente ed il rivelatore possono essere posti più vicino al campione nello strumento più semplice e ciò ne incrementa la sensibilità. 37

38 Applicazione dei metodi di fluorescenza I metodi di fluorescenza sono più sensibili dei metodi basati sull assorbimento da uno a tre ordini di grandezza poiché la loro sensibilità può essere aumentata sia mediante l aumento di potenza del raggio di eccitazione sia amplificando il segnale del rivelatore. 38

39 Metodi fluorimetrici per specie inorganiche Esistono due diversi metodi fluorimetrici applicabili alle specie inorganiche: metodi diretti: basati sulla reazione dell analita con un agente chelante per formare un componente che sia fluorescente metodi indiretti: basati sulla diminuzione o estinzione della fluorescenza di un reagente come risultato della sua reazione con l analita 39

40 Metodi fluorimetrici per specie inorganiche metodi diretti: vengono usati principalmente per la determinazione dei cationi metodi indiretti: vengono usati soprattutto per la determinazione degli anioni 40

41 Reagenti fluorimetrici I reagenti fluorimetrici più efficaci per la determinazione dei cationi sono composti aromatici con due o più gruppi funzionali donatori che permettono la formazione di chelati con lo ione metallo. 41

42 Reagenti fluorimetrici 42

43 Metodi fluorimetrici per specie organiche e biochimiche Il numero delle applicazioni dei metodi fluorimetrici in questo settore è notevole. Indiscutibilmente la sensibilità e la selettività del metodo lo rendono uno strumento particolarmente valido per l analisi di prodotti alimentari, farmaceutici, campioni clinici e prodotti naturali. 43

44 Spettroscopia Molecolare di Fosforescenza La fosforescenza è un fenomeno di fotoluminiscenza abbastanza simile alla fluorescenza. La fluorescenza avviene con transizioni da uno stato eccitato di singoletto ad uno stato fondamentale di singoletto (vita molto breve 10-5 s o meno) La fosforescenza molecolare coinvolge invece una transizione a uno stato eccittato di tripletto ad uno stato fodamentale di singoletto. Tale transizione è molto meno probabile (vita media da 10-4 s a 10 4 s) Fondamentale singoletto Eccitato singoletto Eccitato tripletto 44

45 Spettroscopia Molecolare di Fosforescenza La lunga vita media della fosforescenza è anche uno dei suoi svantaggi. Iprocessi non radiativi possono competere per disattivare lo stato eccitato. Per aumentare questa efficienza generalmente si abbassava la temperatura in matrici rigide come I vetri. Oggi è possibile la fosforescenza a temperatura ambiente. In questa tecnica la molecola viene adsorbita su un asuperficie solida o racchiusa in un acavità molecolare (MICELLE o CAVITA della ciclodestrina) Fondamentale singoletto Eccitato singoletto Eccitato tripletto 45