Principali sistemi sperimentali e tecniche di microscopia integrata alla biologia molecolare e alla biochimica per lo studio del differenziamento
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- Gaspare Costa
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1 Principali sistemi sperimentali e tecniche di microscopia integrata alla biologia molecolare e alla biochimica per lo studio del differenziamento cellulare delle piante Anti-tubulina SEM Confocale
2 Microscopia ottica Ad oggi, il MO è lo strumento di indagine microscopica più utilizzato nei laboratori di ricerca biologica e medica Ingrandimento e risoluzione adatti allo studio di cellule eucariotiche
3 Microscopia ottica La cellula vegetale ha, generalmente, dimensioni molto superiori rispetto ad una cellula animale
4 Microscopia ottica Le dimesioni della cellula vegetale sono molto variabili: da alcune decine ad alcune centinaia di μm
5 Microscopia ottica Il microscopio da biologia è un: microscopio composto a luce trasmessa in campo chiaro
6 Microscopia ottica Nelle cellule vegetali, il differenziamento cellulare si manifesta come acquisizione di una forma definitiva, imposta dalla forma della parete cellulare
7 Microscopia a fluorescenza Ha permesso di osservare dettagli delle cellule vegetali, non distinguibili in campo chiaro. Nel percorso ottico è stata inserita una sorgente luminosa i grado di eccitare la fluorescenza di particolari molecole naturalmente presenti nel campione o aggiunte durante la preparazione. GFP Ioduro di propidio
8 Il microscopio a fluorescenza (MF) Il MF è un microscopio ottico in grado di generare una radiazione luminosa monocromatica
9 Il microscopio a fluorescenza (MF) È un microscopio ottico modificato, che può operare anche in campo chiaro
10 Il microscopio a fluorescenza (MF) Microscopio ottico in campo chiaro Microscopio ottico a fluorescenza
11 Il microscopio a fluorescenza (MF) UV Spettro della luce emessa da una lampada a vapori di mercurio.
12 Il termine fluorescenza Deriva dal nome della fluorite (o fluoruro di calcio) Luce bianca UV Molti altri composti organici e inorganici possono emettere fluorescenza (fluorofori o fluorocromi)
13 I fluorofori I fluorofori, se esposti ad una radiazione di una determinata lunghezza d onda (radiazione incidente) emettono luce di un altra lunghezza d onda (fluorescono) UV Red radiazione incidente radiazione emessa Clorofilla
14 Struttura dei fluorofori La capacità di fluorescere è legata alla struttura chimica dei fluorofori, in particolare alla presenza di sistemi di doppi legami coniugati
15 Meccanismo della fluorescenza λ assorbita Calore λ emessa La radiazione emessa ha una lunghezza d onda maggiore (energia minore) rispetto alla radiazione incidente (parte dell energia viene dissipata come calore)
16 Spettri di assorbimento e di emissione Se si espone un fluoroforo a una gamma di lunghezze d onda crescenti, si può costruire uno spettro di assorbimento e uno spettro di emissione SA SE
17 spettri di emissione spettri di assorbimento Picchi di assorbimento e di emissione Ciascun fluoroforo è caratterizzato da un picco di assorbimento (max eccitazione) e da un picco di emissione (max emissione)
18 Autofluorescenza Molte molecole presenti nella cellula vegetale sono naturalmente fluorescenti, quindi per essere visualizzate con il MF non richiedono trattamenti
19 Fluorescenza secondaria Molte molecole presenti nella cellula vegetale non sono naturalmente fluorescenti e per essere osservate in fluorescenza devono essere rese fluorescenti: 1) Reagenti cito- e isto-chimici fluorescenti (es. DAPI e PI per gli acidi nucleici) 2) Anticorpi coniugati con fluorofori (immunofluorescenza) 3) Proteine fluorescenti (es. GFP) 4) Sonde di altro tipo (es. sonde ad RNA o DNA usate nell ibridazione in situ)
20 1) Reagenti cito-isto-chimici fluorescenti Il DAPI (4',6-diamidin-2-fenilindolo) è un agente intercalante del DNA, si fissa alla doppia elica in corrispondenza delle basi A e T
21 1) Reagenti cito-isto-chimici fluorescenti Lo ioduro di propidio si lega sia al DNA che al RNA Ioduro di propidio Per distinguere tra DNA o RNA occorre utilizzare delle nucleasi (che digeriscano l uno o l altro)
22 2. immunofluorescenza Anticorpi coniugati con fluorofori
23 Legame antigene-anticorpo L anticorpo riconosce e si lega a specifici elementi strutturali dell antigene dette epitopi Antigene = molecola target Epitopo = sito di legame dell anticorpo Anticorpo = immunoglobulina
24 Immunoglobuline Nella tecnica dell immunofluorescenza vengono utilizzate principalmente le IgG
25 Marcatura dell anticorpo Il primo passo consiste nella marcatura dell'anticorpo con un fluoroforo fluoroforo FAB (di riconoscimento) Catene pesanti FC (effettrice) Il fluoroforo deve essere legato alla zona FC poiché, se fosse legato alla zona FAB, l'immunoglobulina potrebbe perdere la sua funzionalità
26 Anticorpi policlonali e monoclonali Antigene Si inietta l antigene in un animale da laboratorio Linfocita B Diversi linfociti B riconoscono diversi epitopi dell antigene Plasmacellule Si formano diversi cloni di plasmacellule, ciascuno producente un anticorpo Rischio di falsi positivi per cross-reatività!
27 Anticorpi policlonali e monoclonali Produzione di anticorpi monoclonali MONOCLONALI Prodotti da un unico clone di linfociti B Gli anticorpi riconoscono un unico epitopo Rischio di falsi negativi per denaturazione del sito antigenico
28 Immunofluorescenza diretta e indiretta DIRETTA: La marcatura viene effettuata sullo stesso anticorpo che riconosce l antigene della molecola target Molecola target Anticorpo primario Epitopo Fluoroforo
29 Immunofluorescenza diretta e indiretta INDIRETTA: L anticorpo primario non marcato riconosce l'antigene L anticorpo secondario marcato, riconosce l anticorpo primario Molecola target Epitopo 1 Fluoroforo Anticorpo primario Anticorpo secondario anticorpo anti-anticorpo
30 Immunofluorescenza diretta e indiretta INDIRETTA: Uno dei principali vantaggi è dato dall amplificazione del segnale: ad un singolo epitopo possono legarsi numerosi anticorpi secondari Molecola target Anticorpo primario 1 Epitopo Segnale
31 3) Proteine fluorescenti GFP (Green Fluorescent Protein) Aequorea victoria GFP Il gene codificante la GFP è stato sequenziato negli anni 60 Nel 2008 i suoi scopritori sono stati insigniti del Nobel per la chimica
32 Principali caratteristiche di GFP Max abs 395 nm (UV) 27 Kda 238 aa Max flu 505 nm (verde) Max abs 475 nm (azzurro) La porzione fluorescente della molecola è parte della sequenza amminoacidica ed è posta al centro di una struttura cilindrica
33 Applicazioni di GFP Inizialmente il gene per GFP era utilizzata come reporter in esperimenti di trasformazione genica Attualmente è utilizzata principalmente per sviluppare costrutti genici in cui la sequenza codificante per GFP è affiancata ad altre sequenze
34 Osservazioni su organismi vivi Le proteine chimeriche fluorescenti sono fluorofori endogeni estremamente selettivi, poichè legati alla proteina di interesse Non essendo necessario alcun trattamento dei campioni, è possibile osservare in fluorescenza anche organismi vivi
35 Altre proteine fluorescenti GFP è il capostipite di un ampia gamma di proteine fluorescenti naturali: DsRed (da meduse del genere Discosoma). semisintetiche: EGFP (Enhanced GFP).. CFP (Cyan Fluorescent Protein). YFP (Yellow Fluorescent Protein) Attualmente si annoverano circa 60 proteine fluorescenti, ma questo numero aumenterà notevolmente nei prossimi anni.
36 Colorazioni combinate L uso combinato di più colorazioni complementari, vale a dire che emettano fluorescenza in zone diverse dello spettro, permette di realizzare una marcatura policroma e di evidenziare quindi strutture biologiche diverse in un medesimo campione Anti-tubulina FITC Sovrapposizione
37 4) Ibridazione in situ Le tecniche di ibridazione in situ si basano sulla capacità degli acidi nucleici a sequenza complementare di formare doppi filamenti (ibridazione) T T A C C T T T C C A T C G T T A C C T T T C C A T C G A A T G G A A A G G T A G C A A T G G A A A G G T A G C Acidi nucleici complementari Ibridazione Doppio filamento
38 Applicazioni dell ibridazione in situ Le finalità della tecnica sono principalmente 2: 1. Se il target è un RNA, si può studiare l espressione di un gene a livello tissutale e cellulare 2. Se il target è il DNA, si può studiare la localizzazione di specifiche sequenze nucleotidiche sui cromosomi
39 4) Ibridazione in situ Studio dell espressione genica Tecniche biomolecolari convenzionali (qrt-pcr) Ibridazione in situ Espressione genica a livello di: 1) organismo; 2) organo Espressione genica a livello: 1) tissutale; 2) cellulare
40 4) Ibridazione in situ Localizzazione cellulare e tissutale dell espressione genica
41 Microdissezione laser Una tecnica alternativa all ibridazione in situ per lo studio dell espressione genica a livello cellulare e tissutale è la microdissezione laser
42 Ibridazione in situ vs Microdissezione laser espressione genica a livello cellulare e tissutale ibridazione in situ Microdissezione laser Localizzazione Localizzazione Quantificazione
43 4) Ibridazione in situ La localizzazione della sequenza target è effettuata in tessuti morfologicamente conservati mediante l impiego di sonde geniche marcate Sonda Cellula 1 Cellula 1 Ibridazione Cellula 2 Cellula 2 Target
44 Ibridazione in situ Metodi diretti La molecola reporter (fluoroforo o cromoforo) è legata alla sonda prima di effettuare l ibridazione Marcatura sonda Ibridazione Osservazione
45 Ibridazione in situ Metodi indiretti Il bersaglio viene ibridato con una sonda non marcata e complesso target/sonda viene poi rivelato trattando il campione con reagenti specifici per la sonda Sonda non marcata Ibridazione Rivelazione dell ibrido Osservazione
46 Ibridazione in situ ed espressione genica In genere si usano delle (sonde a RNA) marcate, complementari sugli RNA target (il legame RNA-RNA è molto stabile). Il legame RNA-RNA è molto più forte del legame DNA-RNA L RNA è molto instabile, quindi difficile da maneggiare Legame più stabile Legame meno stabile
47 Ibridazione in situ ed espressione genica Le sonde possono essere marcate con molecole fluorescenti (fluorofori) o con molecole colorate (cromofori) Marcatura della ribosonda con digossigenina Rivelazione degli ibridi con anticorpo antidigossigenina
48 Ibridazione in situ e mappatura cromosomica (FISH)
49 FISH: classificazione delle sonde
50 FISH: chromosome painting Sonde: collezione di frammenti specifici di un singolo cromosoma Cromosomi fluorescenti con colori diversi
51 Microscopia confocale Microscopio a fluorescenza Microscopio confocale Sorgente luminosa: LASER (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) Tutti i piani dell oggetto sono a fuoco
52 Microscopia confocale LASER Monocromatico Fotoni paralleli
53 Microscopia confocale Microscopio a fluorescenza Microscopio confocale
54 Schema di un microscopio confocale Fotomoltiplicatore Pinhole di eccitaz. Pinole di emissione Specchio dicroico Fibre ottiche LASER Obiettivo Campione
55 Sezione ottica Il piano di messa a fuoco viene scansionato Per ciascun pixel vengono acquisite 3 informazioni: 1) Posizione sull asse X 2) Posizione sull asse Y 3) Intensità luminosa
56 Sezioni ottiche Helianthus annuus SEM
57 Ricostruzione tridimensionale Per ciascun voxel vengono acquisite 4 informazioni: 1) 2) 3)Posizione sugli assi X, Y e Z 4) Intensità luminosa
58 Ottenimento di sezioni del campione
59 Rappresentazione della tridimensionalità
Microscopia a fluorescenza
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