Elementi di genetica di base e marcatori molecolari. Dott.ssa Marica Soattin

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1 Elementi di genetica di base e marcatori molecolari Dott.ssa Marica Soattin

2 Organismi animali costituiti da cellule di tipo eucariote Cellule con nucleo differenziato delimitato da membrana e organelli subcellulari (es. mitocondri) Genoma: l insieme del materiale ereditario contenuto in una cellula

3 Cromosomi Cromosoma Unità strutturale e colorabile dei nuclei che porta i geni disposti in modo lineare. Considerato anche come un insieme di geni (gruppo di associazione) organizzati secondo una successione lineare che tendono ad essere ereditati insieme. Specie 2n=2x Uomo 46 Bovino 60 Suino 36 Ovino 54 Cavallo 64 Cane 78 Nelle specie a determinazione cromosomica del sesso si distinguono: Autosomi Tutti i cromosomi non sessuali Cromosomi sessuali Determinano il sesso di un individuo Mammiferi: XX femmina, XY maschio Uccelli: ZW femmina, ZZ maschio

4 Cariotipo Numero, dimensione e morfologia dei cromosomi metafasici caratteristico di ciascuna specie Cariotipo umano

5 Struttura dei cromosomi Telomero Centromero Eterocromatina: regioni fortemente condensate e intensamente colorabili del cromosoma eurcariotico. Generalmente presente a livello dei centromeri e telomeri. Telomero Eucromatina: regioni poco condensate sparse lungo i bracci del cromosoma eucariotico che sono attive in termini di trascrizione

6 Visualizzazione cromosomi: tecniche FISH e GISH

7 Numeri cromosomico somatico 2n: numero di cromosomi contenuti nelle cellule somatiche gametico n: numero di cromosomi contenuti nei gameti maschili e femminili 2n è dunque costituito da due corredi cromosomici: n di origine materna e n di origine paterna madre Coppia di omologhi padre

8 DNA (acido deossiribonucleico): doppia elica destrosa con due catene polinucleotidiche antiparallele avvolte l una sull altra in una spirale che costituisce il materiale genetico. Ogni filamento è formato da una successione monotona di gruppi fosfato e zuccheri pentosi (deossirbosio) con le 4 basi azotate (A, T, G, C) situate perpendicolarmente all asse dell elica e sono tenute insieme a quelle dell altro filamento da legami H: A con T (2 legami) C con G (3 legami) Materiale ereditario Il DNA è dunque in grado di duplicarsi: una catena funge da stampo per la sintesi dell altra in presenza dell enzima DNA polimerasi MECCANISMO ALLA BASE DELL EREDITARIETA

9 DNA contiene l informazione necessaria per la nascita, lo sviluppo e il mantenimento degli organismi viventi GENE: Frazione di DNA che presiede alla sintesi di una particolare catena polipeptidica attraverso uno specifico mrna intermedio Unità ereditaria fisica e funzionale responsabile del trasferimento dell informazione genetica da una generazione alla successiva e della manifestazione fenotipica dei caratteri. Ogni cellula possiede il corredo genetico completo ma a seconda del tessuto a cui appartiene, geni diversi si attivano e vengono trascritti e quindi tradotti in proteine es. geni proteine latte sono attivi solo nelle femmine e nelle cellule della ghiandola mammaria

10 ALLELE una delle possibili forme alternative di un gene presente in una specifica localizzazione cromosomica (locus) LOCUS sito occupato da un gene nel cromosoma Locus INRA023

11 Omozigote: individuo che presenta la stessa forma allelica in loci corrispondenti di cromosomi omologhi Eterozigote: individuo che presenta forme alleliche diverse in loci corrispondenti di cromosomi omologhi Es. L allele A codifica per il NERO; a per il ROSSO Omozigoti: AA o aa Eterozigoti: Aa L informazione genetica (GENOTIPO) determina un carattere visibile dell animale (FENOTIPO) Individuo AA: doppia informazione per il colore nero Individuo aa: doppia informazione per il colore rosso Individuo Aa: informazione per entrambi i colori del mantello MANTELLO NERO MANTELLO ROSSO???

12 Interazioni alleliche DOMINANZA/RECESSIONE: uno dei due alleli (dominante) maschera l altro, che è detto recessivo; A èdominante su a: mantello a macchie NERE CODOMINANZA: nell eterozigote entrambi gli alleli si esprimono e sono riconoscibili nel fenotipo; mantello a macchie ROSSE e NERE DOMINANZA INCOMPLETA: nell eterozigote l effetto dei due alleli si somma; mantello a macchie di colore di colore intermedio fra rosso e nero EPISTASIA: il fenotipo è influenzato dall interazioni alleliche di due o più geni

13 Esempio : gruppi sanguigni nell uomo Alleli possibili: A, B, 0 A e B sono fra loro codominanti A e B sono dominanti rispetto a 0 Padre/Madre A B 0 A AA AB A0 B AB BB B0 0 A0 0B 00 Genotipi AA, A0 BB, B0 AB 00 Fenotipi A B AB 0

14 Caratteri qualitativi Caratteri controllati in maniera semplice da uno o pochi geni Es. presenza di corna colore del guscio dell uovo Gli individui di una data popolazione possono essere assegnati ad una categoria o ad un altra. La variabilità è di tipo discontinuo. Le osservazioni su una popolazione sono descritte da un istogramma di frequenza Fenotipo = Genotipo 30 Carattere in esame Fenotipo1 Fenotipo2 Fenotipo3

15 Caratteri quantitativi Per la maggior parte dei caratteri, il fenotipo è condizionato dall ambiente e quindi si considera valida la seguente regola generale: Fenotipo (P) = Genotipo (G) + Ambiente (E) E = clima, alimentazione, età, Influenza limitata sui caratteri qualitativi Influenza sostanziale sui caratteri quantitativi I caratteri quantitativi presentano una variabilità di tipo continuo Es. produzione di latte spessore del grasso

16 Caratteri quantitativi Caratteri la cui espressione dipende dall azione di più geni che presentano più varianti ciascuno A B C D E F G es. 1 gene, 7 varianti e 7 fenotipi diversi A B C D E F G H I L M N O P es. Molti geni con x varianti, 14 fenotipi risultato della combinazione dell effetto di tali varianti Più geni, più varianti, effetti ambientali la distribuzione da discreta diventa continua

17 Varianti alleliche Misure di variabilità genetica Numero di alleli per un dato locus Numero di individui eterozigoti (Aa) Responsabili del POLIMORFISMO del genoma VARIABILITÀ GENETICA

18 Classi di marcatori genetici Morfologici la variabilità è espressa a livello fenotipico: - caratteri mendeliani (caratteri qualitativi) Biochimici: La variabilità è osservabile attraverso analisi biochimiche: - gruppi sanguigni - isoenzimi (forme alternative di uno stesso enzima, dette isoforme, che svolgono la stessa funzione in un dato organismo anche se possono differenziarsi per uno o più aminoacidi) - proteine (del plasma, del latte etc.) Molecolari: La variabilità è osservabile a livello genomico - SNP, microsatelliti, RFLP, AFLP, RAPD,

19 Marcatori molecolari: definizione Rilevano la diversità dovuta a mutazioni di regioni di DNA omologhe in individui diversi appartenenti alla stessa specie o a specie diverse. Un marcatore molecolare può essere definito come quel locus genomico, rilevabile con sonde (=probe) o inneschi (=primer) specifici che, in virtù della sua presenza, contraddistingue in modo caratteristico ed inequivocabile il tratto cromosomico con il quale si identifica e le regioni che lo circondano alle estremità 5 e 3.

20 Marcatori molecolari: caratteristiche Si basano sulla rilevazione di differenze (=polimorfismi) nella sequenza nucleotidica del DNA, differenze dovute ad inserzioni, delezioni, traslocazioni, duplicazioni, mutazioni puntiformi ecc.. - Non subiscono interferenze da parte dell ambiente - Coprono qualsiasi parte del genoma permettendo di rilevare differenze anche tra individui geneticamente simili e fenotipicamnete indistinguibili - Non presentano effetti epistatici o pleiotropici - In molti casi sono codominanti consentendo così la distinzione dell eterozigote dall omozigote - Strumenti di indagine estremamente efficaci ed affidabili e trovano larga applicazione nella ricerca di base e in quella applicata.

21 Marcatori molecolari: riassumendo Non influenzati dall ambiente Analisi indipendenti da sesso ed età Campioni di qualsiasi tessuto Neutrali Stabili Numerosi Polimorfici Generalmente codominanti Facili da monitorare Analisi automatizzabili

22 Classi di marcatori molecolari Basati su ibridazione di tipo Southern (Southern Blot Hybridization, SBH) Basati sulla Reazione a Catena della Polimerasi (PCR, Polymerase Chain Reaction) SBH PCR RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) SAMPL (Selective Amplified Microsatellite Polymorphic locus) S-SAP (Sequence Specific Amplification Polymorphism) RAPD (Random Amplified Polymorphich) AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction) I-SSR (Inter-simple Sequence Repeat) CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) SSR (Simple Sequence Repeat) SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Singolo-locus Multi-locus Singolo-locus

23 PCR (Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis ideatore nel 1986 Consente di sintetizzare ripetutamente (amplificare) per via enzimatica uno specifico segmento di DNA situato tra due regioni di sequenza nucleotidica nota, producendone un numero elevato di copie attraverso una serie di reazioni di: -denaturazione (95 C) -appaiamento degli inneschi (primer) (40-68 C) -polimerizzazione dei nuovi frammenti ad opera della Taq Polimerasi (72 C) La reazione viene effettuata in un termociclatore (Thermal Cycler) I prodotti sono visualizzati in gel d agarosio

24 Meccanismo della PCR Amplificazione esponenziale

25 PCR: dalla teoria alla pratica..

26 Elettroforesi Tecnica che permette di visualizzare e separare acidi nucleici e proteine Principio: i frammenti di DNA migrano attraverso un materiale selettivo (es. gel di agarosio) che li separa in base alle dimensioni (peso molecolare/lunghezza); frammenti più piccoli migrano attraverso le maglie del gel più velocemente, quelli più grandi si muovono più lentamente. Pozzetti nei - quali viene caricato il DNA Direzione campo elettrico + Marker di peso molecolare

27 Enzima di restrizione (endonucleasi di restrizione) Enzima di origine batterica capace di tagliare molecole di DNA a doppia elica in corrispondenza di una specifica sequenza nucleotidica (sito di restrizione) producendo frammenti di dimensioni variabili. G AATT C C TTAA G T CG A AGC T Sito di taglio EcoRI Sito di taglio TaqI Disponendo della sequenza di un frammento di DNA è possibile ottenere delle mappe di restrizione

28 Marcatori che prevedono l impiego di enzimi di restrizione RFLP, AFLP e AFLP-derivati Evidenziano differenze a livello di siti di restrizione dovuti a delezioni/inserzioni Allele 1 Allele 2 X Sequenza di taglio dell enzima di restrizione

29 Caratteristiche AFLP e AFLP-derivati Numerosi e presenti in tutto il genoma Non richiedono conoscenza a priori di sequenze genomiche per la costruzione dei primer Messa a punto più rapida, poco dispendiosa (tempo e costi) Spesso si ricorre a marcatura radioattiva dei primer Bassa informatività per singolo marcatore (biallelici), alta informatività per analisi Tempi di analisi più lunghi vs. microsatelliti

30 AFLP Marcatore polimorfico Marcatore monomorfico

31 MICROSATELLITI Ripetizioni in tandem di corte sequenze di nucleotidi: ACACACACACACACAC (AC) n GTGTGTGTGTGTGTGTGTG (GT) n CACCAC CAC CAC CAC (CAC) n GATAGATA GATA GATA (GATA) n Distribuite nel genoma in numero elevatissimo Il polimorfismo èmolto elevato e deriva dal numero di ripetizioni del motivo di base del microsatellite n Le regioni fiancheggianti tali ripetizioni sono conservate entro la specie e spesso anche tra le specie

32 MICROSATELLITI Attraverso le regioni conservate è possibile costruire delle sonde (primer) che permettono di rilevare queste regioni ripetute La tecnica utilizzata per la loro rilevazione è la PCR

33 Analisi con microsatelliti 1) ESTRAZIONE DEL DNA Sangue Pelo Feci Seme DNA totale 2) PCR Con primer specifici che appaiano alle regioni fiancheggianti l elemento ripetuto 3) ELETTROFORESI Su gel di acrilammide al 6-7%

34 Elettroforesi capillare Il principio è lo stesso dell elettroforesi classica : i frammenti di DNA migrano attraverso una resina selettiva all interno di un capillare che li separa in base alle dimensioni (peso molecolare/lunghezza); frammenti più piccoli migrano attraverso le maglie della resina più velocemente, escono prima dal capillare e vengono intercettati per primi dal sistema di rivelazione. Tale dispositivo emette un raggio luminoso che colpisce i frammenti di DNA che, se marcati con molecole fluorescenti, a loro volta emettono un segnale in uscita che viene registrato. Il risultato è un elettroferogramma.

35 Elettroferogramma L intensità del segnale dipende dalla quantità di frammento e determina l area e l altezza dei picchi La lunghezza esatta del frammento (in paia di basi) viene determinata confrontando i prodotti in esame con uno standard (ROX 400) 50 bp 100 bp 200 bp 290 bp 400 bp

36 MICROSATELLITI Numerosi e presenti in tutto il genoma Alto polimorfismo (multiallelici) Codominanti Facili da rilevare (analisi veloci, dopo che la metodologia è stata messa a punto)

37 MICROSATELLITI Messa a punto onerosa (tempo e costi) è basata sull individuazione della localizzazione genomica (locus) del marcatore per la costruzione di primer locusspecifici Tuttavia Attualmente, per le specie animali più studiate (bovini, ovini, caprini) sono disponibili centinaia di marcatori microsatellite già mappati Inoltre la possibilità di trasferimento inter-specie, data la conservazione delle sequenze fiancheggianti, li rende applicabili anche a specie meno studiate es. ungulati selvatici

38 SNPs (Single nucleotide polymorphisms) Polimorfismi a livello di singoli nucleotidi GAT CAG TTC GAT GTC GAT CAG TTT GAT GTC

39 SNPs Marcatori (di fatto) biallelici 1. Frequenza di sostituzione a livello di singole basi è bassa, 1x x10-9 per nucleotide per anno (mammiferi) Probabilità di due cambi di base indipendenti è molto bassa 2. Prevalenza di due tipi di mutazione preferenziali: transizioni (A<=>G) e (C<=>T) (transizioni:trasversioni= 1:1.7 nell uomo) CpG nucleotidi sono soggetti a deaminazione della C in T Alti livelli di SNPs in cui C<=>T e quindi nell altro filamento A<=>G

40 Caratteristiche SNPs Numerosità (sono milioni) Alta riproducibilità e accuratezza Analisi è automatizzabile Sono spesso contenuti nei geni espressi Richiedono un lungo lavoro di messa a punto (per l individuazione del marcatore) Ne servono molti di più in fase di genotipizzazione (vs. microsatelliti ad es.)

41 Rilevazione dei marcatori SNPs Sono visualizzati attraverso sequenziamento di prodotti di PCR di campioni di DNA isolati da un certo numero di individui geneticamente differenziati oppure Ricerca in silico interrogando le principali banche dati genomiche e selezionando un certo num di seq riconducibili ad un det gene clonato in individui diversi della stessa specie

42 Sequenziamento Fonte: Barcaccia Volume III

43 Aplotipo: definizione Insieme di alleli marcatori a loci strettamente associati che tendono ad essere ereditati in blocco e che consentono di identificare un singolo genotipo in maniera univoca

44 Esempio di applicazione dei marcatori molecolari Marcatore I-SSR co-segregante con il colore del fiore E4 FB4 F1