Downloaded from Riarrangiamento dei geni per le Immunoglobuline e sviluppo dei linfociti B

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1 Downloaded from Riarrangiamento dei geni per le Immunoglobuline e sviluppo dei linfociti B

2 I geni che codificano i recettori per gli antigeni (BCR e TCR) sono presenti in uno stato non funzionale nella linea germinale Diversi eventi di ricombinazione devono avvenire durante lo sviluppo di ciascun linfocita per rendere funzionali questi geni Ciascun evento richiede l introduzione di doppie rotture nel DNA cromosomico

3 Chromosome localization of Ig loci

4 Sia le catene leggere che le catene pesanti sono codificate da famiglie multi-geniche separate Nel DNA della linea germinale ciascuna famiglia multigenica contiene diverse sequenze codificanti, dette segmenti genici, separate da regioni non codificanti Durante la maturazione dei linfociti B questi segmenti genici vengono riarrangiati Il riarrangiamento crea un esone funzionale corrispondente alla regione variabile

5 La regione V L è codificata da più di un segmento genico La regione variabile della catena leggera (V L ) è codificata da 2 segmenti genici segmento genico V codifica per i primi a.a. segmento genico J codifica per pochi a.a. (fino a 13) Il riarrangiamento dei segmenti V e J crea un esone continuo (VJ) che codifica per l intera regione V L

6 Downloaded from Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig V L C L

7 La regione V H è codificata da più di un segmento genico La regione variabile della catena pesante (V H ) è codificata da 3 segmenti genici segmento genico V segmento genico D segmento genico J Il riarrangiamento dei segmenti V, D e J crea un esone continuo (VDJ) che codifica per l intera regione V H

8 Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig V H C m1 C m2 C m3 C m4

9 Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig V H C m1 C m2 C m3 Cm1 Cm2 Cm3 Cm4 TM Cyt C m4

10 Germline organization of Ig light- and heavy-chain loci in human genome

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12 DNA catena k germ-line Riarrangiamento catena k V-J joining DNA catena k riarrangiato Trascritto primario catena k Trascrizione

13 Trascritto primario catena k RNA splicing + poliadenilazione mrna catena k Coda poli-a Traduzione Polipeptide nascente catena k Catena k

14 Riarrangiamento catena pesante DNA catena H germ line D-J joining V-DJ joining DNA catena H riarrangiato Trascrizione Trascritto primario

15 Co-espressione di IgM e IgD Nelle cellule B naive il trascritto primario della catena pesante contiene sia gli esoni per i domini costanti della catena m che della d il trascritto primario non contiene esoni per altre catene pesanti (g, e, a) Attraverso lo splicing alternativo vengono prodotti sia mrna per m che per d La cellula B naive co-esprime IgM e IgD con la stessa specificità antigenica stesso esone VDJ per dominio variabile delle catene pesanti m e d catena leggera associata identica Le altre classi di Ig non sono mai co-espresse

16 Trascritto primario catena H splicing alternativo mrna catena H Polipeptide nascente catena H Catena H Catena Hm Catena Hd

17 Recombination Signal Sequence, RSS Accanto a ciascun segmento genico sono presenti delle sequenze dette recombination signal sequences (RSS) 1 RSS è collocata al 3 di ciascun segmento V 1 RSS è collocata al 5 di ciascun segmento J 1 RSS è presente al 5 e un altra al 3 di ciascun segmento D Queste sequenze funzionano da segnali per i processi di ricombinazione

18 Recombination Signal Sequence, RSS Ciascuna RSS contiene NONAMERO: sequenza conservata non codificante di 9 nucleotidi sito di legame per RAG1; ancora le proteine RAG al DNA EPTAMERO: sequenza conservata non codificante di 7 nucleotidi aumenta legame di RAG, specifica sito di taglio eptamero e nonamero sono separati da uno spacer di 12 o 23 paia di basi lo spacer varia di sequenza ma la sua lunghezza è conservata e corrisponde a uno (12 bp) o due (23 bp) giri di DNA doppia elica la lunghezza dello spacer è cruciale per la ricombinazione permette corretta giustapposizione di nonamero ed eptamero

19 Sequenze RSS

20 Regola 12/23 Un segmento genico fiancheggiato da una RSS con uno spacer di 12 bp può ricombinare con un segmento fiancheggiato da uno spacer con 23 bp

21 Il complesso della ricombinasi V(D)J Il complesso di enzimi che opera la ricombinazione somatica V(D)J è detto ricombinasi V(D)J Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2 i prodotti di questi geni costituiscono la componente della ricombinasi specifica dei linfociti (B e T) necessari per la generazione dei recettori per l antigene topi KO per uno dei due geni Rag non sviluppano linfociti B né T sono espressi durante lo sviluppo dei linfociti solo quando avviene il riarrangiamento dei geni per il recettore dell antigene La ricombinasi V(D)J include anche enzimi espressi ubiquitariamente e coinvolti nella riparazione del DNA DNA ligasi IV, DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), Ku70/80, Artemis La ricombinazione avviene alle giunzioni tra le sequenze RSS e le sequenze codificanti

22 Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2 Proteine nucleari, altamente conservate in vertebrati Costituiscono la componente della ricombinasi specifica dei linfociti (B e T) Necessari per la generazione dei recettori per l antigene Il core di RAG-1 contiene regione per legame a nonamero regione centrale che interagisce con eptamero e RAG2 sito catalitico per taglio DNA

23 Il core di RAG-2 Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2 è necessario per il taglio del DNA interagisce con RAG1 aumenta l affinità di legame con il DNA RAG2 contiene una regione che lega la lisina 4 trimetilata dell istone H3 (H3K4me3) guidando il complesso RAG nelle regioni di cromatina attiva

24 Fasi della ricombinazione 1 RAG1 e RAG2 riconoscono RSS (alla formazione del complesso partecipano anche altre proteine) le RSS di un segmento V e di uno J sono portate in prossimità Segmento genico V RSS - 1 giro Segmento genico J RSS - 2 giri

25 Fasi della ricombinazione 2 taglio di un filamento di DNA da parte di RAG-1 e RAG-2 alla giunzione delle RSS con le sequenze codificanti tra eptamero e segmento genico codificante Segmento genico V RSS - 1 giro Segmento genico J RSS - 2 giri

26 Downloaded from Fasi della ricombinazione 3 l estremità tagliata del segmento genico codificante, viene unita al filamento opposto producendo una forcina all estremità della RSS, viene prodotta una doppia rottura del DNA Segmento genico V RSS - 1 giro Segmento genico J RSS - 2 giri

27 Ricombinazione 4 Vengono reclutate altre proteine Ku70/Ku80 La forcina viene tagliata in posizione casuale RAG/Artemis l estremità viene poi modificata da esonucleasi TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) Riparo e legame delle sequenze codificanti e di quelle segnale DNA ligasi IV

28 Generazione della diversità anticorpale (GOD, Generation Of Diversity) Molteplici segmenti genici diverse combinazioni V-(D)-J Flessibilità nel processo di giunzione aggiunta e rimozione di nucleotidi Combinazione di catene pesanti e leggere Ipermutazione somatica in linfociti B attivati

29 200 x 6x10 3 = 1.2x x 6x10 3 = 0.72x10 6 = Possibili combinazioni teoriche 1.92x10 6

30 Variabilità Variabilità Variabilità degli aminoacidi nelle Ig Figure 3-6 HV3 ha una variabilità varibilità maggiore di HV1 e HV2 Regione V catena pesante Regione V catena leggera FR, frame region HV, hyper-variable region

31 La regione del DNA dove avviene la giunzione V(D)J codifica per la regione ipervariabile 3 (HV3) che corrisponde al CDR3 HV1 HV2 HV3 HV regions HV1 HV2 HV3

32 Flessibilità nel processo di giunzione: aggiunta e rimozione di nucleotidi Eptamero della RSS Eptamero della RSS l estremità tagliata del segmento genico codificante, viene unita al filamento opposto producendo una forcina (v. diapo precedenti)

33 Flessibilità nel processo di giunzione: aggiunta e rimozione di nucleotidi (P-addition) Quando la forcina viene tagliata si produce un filamento singolo Gli enzimi di riparazione aggiungono nucleotidi complementari a questa sequenza generando una sequenza palindromica P-nucleotidi Variazioni nella posizione del taglio della forcina generano variazioni in questa sequenza

34 Flessibilità nel processo di giunzione: aggiunta e rimozione di nucleotidi (N-addition) Durante la ricombinazione D-J e V-DJ, la terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) aggiunge fino a 15 nucleotidi a entrambi le giunzioni D-J e V-DJ. I nucleotidi aggiunti generano sequenze randomiche La N-addition contribuisce largamente alla variabilità del CDR3 della catena pesante La N addition si verifica quasi esclusivamente nella catena pesante

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36 Diversità totale (combinazioni V(D)J e catene L/H + diversità giunzioni N/P addition) Ig TCRab Tuttavia, un individuo ha un repertorio di circa 10 7 cloni B e T

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38 Esclusione allelica Ciascuna cellula B esprime i geni riarrangiati della catena pesante di un solo cromosoma e i geni riarrangiati della catena leggera di un solo tipo (k o l) e di un solo cromosoma esclusione allelica Assicura che una cellula B funzionale esprima una sola catena pesante e una sola leggera una sola specificità antigenica

39 Esclusione allelica in singole cellule B Ceppo di aplotipo a/a per la catena pesante delle Ig Ceppo di aplotipo b/b per la catena pesante delle Ig Ibrido F1 di aplotipo a/b per la catena pesante delle Ig I due aplotipi diversi sono espressi in cellule diverse