La glicolisi non è l unica via catabolica in grado di produrre energia. Se il suo prodotto viene ulteriormente ossidato si ottiene molta più energia.

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1 La glicolisi non è l unica via catabolica in grado di produrre energia. Se il suo prodotto viene ulteriormente ossidato si ottiene molta più energia. Il ciclo dell acido citrico è una via metabolica centrale che consente di utilizzare diversi combustibili metabolici oltre al piruvato derivante dalla glicolisi L Acetil-CoA è prodotto da diverse vie metaboliche

2 Il ciclo di Krebs non è semplicemente la continuazione della via glicolitica, ma una VIA CENTRALE del metabolismo Il ciclo dell acido citrico = ciclo di Krebs = ciclo degli acidi tricarbossilici negli eucarioti avviene interamente nei mitocondri tutti i substrati devono essere prodotti nei mitocondri oppure devono venire trasportati all interno di essi. I prodotti e gli intermedi devono essere utilizzati all interno dei mitocondri o trasportati nel citosol successivamente.

3 PROTEINE POLISACCARIDI LIPIDI ATP ATP ATP Aminoacidi Esosi; Pentosi Ac. Grassi; Glicerolo ATP ATP ATP I FASE IDROLITICA a -chetoacidi Piruvato ATP II FASE OSSIDATIVA AcetilCoA Metabolismo dei glucidi III O 2 ATP NH 3 H 2 O CO 2

4 PROTEINE POLISACCARIDI LIPIDI ATP ATP ATP Aminoacidi Esosi; Pentosi Ac. Grassi; Glicerolo ATP ATP ATP I FASE IDROLITICA a-chetoacidi Piruvato ATP II FASE OSSIDATIVA AcetilCoA Metabolismo dei grassi III O 2 ATP NH 3 H 2 O CO 2

5 PROTEINE POLISACCARIDI LIPIDI ATP ATP ATP Aminoacidi Esosi; Pentosi Ac. Grassi; Glicerolo ATP ATP ATP I FASE IDROLITICA a-chetoacidi Piruvato ATP II FASE OSSIDATIVA AcetilCoA Metabolismo dell azoto III O 2 ATP NH 3 H 2 O CO 2

6 Piruvato + CoA + NAD + acetil-coa + CO 2 + NADH La reazione è catalizzata dal complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi. (a) 24 unità di diidrolipoil transacetilasi (E 2 ) circondate da (b) 24 unità di piruvato deidrogenasi (E 1 ) associate a dimeri e 12 unità di diidrolipoil deidrogenasi (E 3 ) (c) = (a) + (b) (in E.coli)

7 Importanza dei complessi multienzimatici 1. La distanza percorsa dai substrati di reazioni poste in sequenza è molto minore 2. La possibilità di reazioni collaterali è diminuita 3. E possibile un controllo coordinato delle reazioni

8 Il complesso della piruvato deidrogenasi necessita di coenzimi e gruppi prostetici tiamina difosfato

9 Il complesso della piruvato deidrogenasi necessita di coenzimi e gruppi prostetici Acido lipoico Lys Lipoamide Diidrolipoamide Acetil-coenzima A

10 Il complesso della piruvato deidrogenasi catalizza 5 reazioni

11 Avvelenamento da Arsenico - O OH As OH Arsenite HS + HS R diidrolipoamide - O S As + 2 H 2 O S R Inattivazione della piruvato deidrogenasi

12 Il ciclo dell acido citrico (ciclo di Krebs, ciclo degli acidi tricarbossilici) è una serie di otto reazioni che ossidano il gruppo acetile dell Acetil CoA a 2 molecole di CO 2, conservando l energia libera in 3 NADH e 1 FADH 2 e 1 GTP

13 1. Citrato sintasi Catalisi acido-base / His-mediata Condensazione di acetil-coa e ossalacetato ( +C-C)

14 2. Aconitasi Isomerizzazione reversibile del citrato + H 2 O + H 2 O cis-aconitato

15 3. Isocitrato deidrogenasi NAD + -dipendente Decarbossilazione ossidativa dell isocitrato isocitrato ossalosuccinato a-chetoglutarato

16 4. a-chetoglutarato deidrogenasi Decarbossilazione dell a-chetoglutarato CoA-SH CO 2 NAD + NADH + H +

17 5. Succinil-CoA sintetasi Accoppiamento di scissione del succinil-coa alla formazione di GTP (o ATP nei batteri)

18 6. Succinato deidrogenasi (legato alla membrana mitoc.) Deidrogenazione stereospecifica del succinato + E-FAD + E-FADH 2 Succinato Fumarato Sarà riossidato nella catena di trasporto degli elettroni

19 7. Fumarasi (fumarato idratasi) Idratazione del doppio legame del fumarato Stato di transizione carbanionico HO H Fumarato Malato

20 8. Malato deidrogenasi HO H O + NAD + + NADH + H + Malato Ossalacetato Il DG di questa reazione è kj mol -1 e la concentrazione di ossalacetato è molto bassa. Tuttavia il DG della reazione della Citrato sintasi è 31.5 kj mol -1. La reazione 1. fortemente esoergonica spinge il processo ciclico anche se il substrato è scarso.

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24 La reazione netta del ciclo TCA è pertanto : 3 NAD + + FAD + GDP + P i + acetil-coa 3 NADH + FADH 2 + GTP + CoA + 2 CO 2 L ossidazione del gruppo acetile a 2 CO 2 coinvolge 4 coppie di elettroni: 3 x NAD + NADH 1 x FAD FADH 2 Gli elettroni trasportati da NAD e FAD vengono inseriti nella catena di trasporto degli elettroni

25 L ipotesi del metabolone 1. Gli enzimi si devono associare in modo specifico (alcuni enzimi isolati appartenenti alla stessa via metabolica tendono ad associarsi) 2. Il metabolone deve essere visualizzabile (gli enzimi del ciclo TCA sono associati al lato interno dell IMM) 3. Il metabolone deve fornire un vantaggio metabolico (regolazione e velocità simulazioni al computer)

26 Regolazione del ciclo dell acido citrico 1. Inibizione da prodotto da parte dell NADH e dell acetil-coa che competono con NAD + e CoA per i siti di legame dei rispettivi enzimi (E 3 ed E 2 del complesso della piruvato deidrogenasi). Questo rallenta anche E 1.

27 Regolazione del ciclo dell acido citrico 2. Modificazione covalente di E 1 del complesso piruvato deidrogenasi mediante fosforilazione/defosforilazione insulina

28 L'insulina è un ormone peptidico prodotto dalle cellule b delle isole di Langerhans all'interno del pancreas; è prodotta come precursore formato da un unico polipeptide da cui viene escisso il peptide C, corto frammento proteico, apparentemente privo di funzioni fisiologiche che, in quanto secreto insieme all'insulina, è un utile indicatore della funzionalità insulare. La forma attiva dell insulina è formata da due catene unite da due ponti solfuro: catena A di 21 aminoacidi e catena B di 30 aminoacidi. Insulina

29 L insulina è un regolatore generale del metabolismo

30 L insulina è il primo prodotto biotecnologico La prima dose di insulina sintetica prodotta grazie a tecniche di ingegneria genetica è stata realizzata nel 1977 da Herbert Boyer utilizzando Escherichia coli come ospite. (primo brevetto e primo farmaco biotecnologico messo in commercio).

31 Le catene A e B vengono prodotte separatamente, in un sistema inducibile, clonando la sequenza nucleotidica codificante in fusione con il gene lacz nel plasmide pbr322, vettore di clonaggio in E. coli. Nel punto di fusione tra lacz la sequenza codificante è stato inserito il codone codificante metionina, che è bersaglio del bromuro di cianogeno e consente il recupero delle catene senza b-galattosidasi.

32 Peptidasi chimiche (non enzimatiche), ad es. il BROMURO di CIANOGENO (CNBr) che scinde sul lato C dei residui di Met

33 Secondo l OMS, le persone affette da diabete in tutto il mondo sono circa 346 milioni. Secondo l'international Diabetes Federation la prevalenza di questa malattia potrebbe arrivare a 552 milioni di persone entro il 2030 GBI Research prevede che il mercato globale delle terapie contro il diabete di tipo 2 potrebbe raggiungere quasi i 40 miliardi di dollari entro il Novo Nordisk è leader mondiale nella vendita dei prodotti a base di insulina, con un valore di mercato stimato in circa 74 miliardi dollari.

34 Regolazione del ciclo dell acido citrico Disponibilità di substrato 2. Inibizione da prodotto 3. Inibizione retroattiva competitiva inibizione attivatori

35 Regolazione del ciclo dell acido citrico Il Calcio (Ca 2+ ) è un regolatore allosterico (attivatore) della : Piruvato deidrogenasi Isocitrato deidrogenasi α-ketoglutarato deidrogenasi (nel muscolo) Il Ca 2+ stimola sia la contrazione muscolare sia la produzione dell energia ad essa necessaria

36 Il ciclo TCA è anfibolico, cioè sia anabolico che catabolico. vie anaboliche reazioni anaplerotiche (= che riempiono)

37 Ala Ser Cys Gly Thr Trp Piruvato Ile Leu Thr Trp CO 2 Glucoso Acetil-CoA Acetoacetato Asn Asp Ossalacetato Citrato Leu Lys Phe Tyr Asp Phe Tyr Ile Met Val Fumarato KREBS Isocitrato CO 2 Succinil-CoA a-chetoglutarato CO 2 Arg Gln Glu Pro His