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1 Enzimi come Biocatalizzatori: pregiudizi Gli enzimi sono delicati Gli enzimi sono costosi Gli enzimi sono attivi solo con i loro substrati naturali Gli enzimi lavorano solo in ambiente naturale Enzimi come Biocatalizzatori: Vantaggi Gli enzimi sono eco-compatibili compatibili A differenza dei metalli pesanti sono biodegradabili e quindi non tossici per l ambiente Gli enzimi sono catalizzatori efficienti Velocità di reazione volte maggiori delle reazioni non catalizzate. Si usano basse quantità di catalizzatore ( %), per catalizzatori artificiali (0.1-1%). 1%).

2 Accelerazione delle reazioni catalizzate da enzimi Più basso è il G, più veloce è il processo Equazione di Eyring Teoria dello stato di transizione Entalpia di attivazione: i cambi nelle energie di legame e interazioni deboli Entropia di attivazione: costi di orientamento dei reagenti (minor disordine), perdita di flessibilità comformazionale, effetti della concentrazione e solvente L enzima riesce a ridurre il G del processo stabilizzando lo stato di transizione del rds e questo accelera la reazione. Questo può essere fatto agendo su entrabi i contributi entalpici ed entropici

3 Cinetiche di Michaelis Menten Pre-steady state: enzima, largo eccesso substrato, sistema non all equilibrio Steady-state: lente variazioni degli intermedi reattivi Cinetica di Michaelis Menten

4 Elevate concentrazioni di substrato Basse concentrazioni di substrato Relazione tra la k cat e la k cat /K m k cat /K m k 1

5 Enzimi come Biocatalizzatori: Vantaggi Gli enzimi reagiscono in condizioni blande: ph=5-8, T=20-40 C. In questo modo reazioni collaterali (racemizzazioni, isomerizzazioni, decomposizioni, riarrangiamenti) vengono minimizzate Gli enzimi sono compatibili tra loro: Lavorando in condizioni simili possono essere usati in reazioni a cascata (cascade reactions) ) che evitano l accumulo di prodotti instabili o permettono di spostare reazioni i di equilibrio i sfavorevoli Gli enzimi non sono confinati al loro ruolo naturale: Possono avere elevate tolleranze verso il substrato e lavorare in solventi diversi dall acqua. Enzimi come Biocatalizzatori: Vantaggi Gli enzimi catalizzano ampie classi di reazioni: In quanto catalizzatori gli enzimi accelerano le reazioni ma non influiscono sull equilibrio termodinamico della reazione. Per cui alcune reazioni catalizzare da enzimi possono essere fatte in entrambi i sensi Vi sono enzimi per quasi tutte le reazioni organiche: Idrolisi-Sintesi di esteri, ammidi, lattoni, lattami, eteri, anidridi di acidi, epossidi, e nitrili. Ossidazioni-Riduzioni di alcani, alcheni, aromatici, alcoli, aldeidi e chetoni, solfuri e solfossidi. Alogenazioni e dealogenazioni, alchilazioni e dealchilazioni, carbossilazioni e decarbossilazioni, isomerizzazioni, reazioni aldoliche e addizioni di Michael.

6 Classificazione di enzimi ( ) 1999) Nomenclatura EC A.B.C.D EC Enzyme Commission A: denota il tipo principale di reazione B. Denota il sottotipo, indicando il tipo di substrato o di molecola l che viene trasferita C: indica la natura del co-substrato D: il numero individuale di enzima

7 Enzimi come Biocatalizzatori Enzimi come Biocatalizzatori: Vantaggi Gli enzimi sono selettivi: Chemoselettivi: i grazie alla loro specificità ità riescono a trasformare un gruppo funzionale in presenza di altri che reagiscono in condizioni confrontabili. Regioselettivi: grazie alla loro struttura tridimensionale vengono riconosciuti gruppi funzionali situati in posizioni diverse del substrato. Stereoselettivi: Gli enzimi sono molecole chirali enantiopure e quindi sono catalizzatori chirali. Possono quindi reagire in maniera diversa con gruppi enantiotopici producendo molecole chirali con un certo grado di arricchimento enantiomerico.

8 Enzimi come Biocatalizzatori: Svantaggi Gli enzimi vengono prodotti in una sola forma enantiomerica: Per via naturale non possono essere preparati enzimi composti da ammino acidi della serie D. Per ottenere l enantiomero opposto devono essere seguite vie alternative. Enzimi come Biocatalizzatori: Svantaggi Gli enzimi richiedono condizioni di reazioni molto specifiche: Il fatto che gli enzimi lavorino in condizioni blande non ci consente di modificare troppo i parametri di reazione (temperatura, ph) per forzare la reazione. Gli enzimi forniscono la massima attività in acqua: L acqua, a causa dell elevata temperatura di ebollizione e la bassa volatilità, non è spesso il miglior solvente per le reazioni organiche. Pochi solventi organici sono solubili con l acqua. Gli enzimi possono lavorare in solventi organici, ma la loro attività cala, di solito di almeno un ordine di grandezza.

9 Enzimi come Biocatalizzatori: Svantaggi Gli enzimi richiedono i loro cofattori naturali: Mentre gli enzimi si sono rivelti molto flessibili nell accettare substrati non naturali, richiedono quasi esclusivamente i loro cofattori naturali. Questi reagenti biologici sono relativamente instabili e troppo costosi per essere usati in quantità stechiometriche. Sino ad ora non si sono trovati sostituti sintetici validi. Gli enzimi possono causare allergie: Devono quindi essere maneggiati con cura, analogamente ai reagenti chimici. Gli enzimi sono proni alla disattivazione: Molte reazioni enzimatiche possono essere inibite sia dai reagenti che dai prodotti, il che comporta un forte calo di attività a concentrazioni elevate di substrato o prodotto. Enzimi come Biocatalizzatori: Svantaggi Inibizione: competitiva (C); non competitiva (NC), incompetitiva (UC). Grafici di Lineweaver-Burk

10 P= prodotto; S= substrato Inibizione competitiva: l inibitore si lega al sito attivo impedendo al substrato di coordinarsi nel modo corretto o di coordinarsi del tutto. Km aumenta all aumentare dell inibitore; Vmax (o kcat) non cambiano. Aumentando la concentrazione di S Vmax può essere raggiunta P= prodotto; S= substrato Inibizione non competitiva: l inibitore si lega ad un altro sito dell enzima. Viene modificata la Vmax ma non la Km. La coordinazione dell inibitore causa per esempio modifiche nella geometria del sito attivo. Possiamo avere coordinazione sia all enzima che al complesso enzima- substrato

11 Inibizione incompetitiva: l inibitore influenza sia la Vmax che la Km. Questo può essere causato da una preferenziale coordinazione al complesso enzima-substrato o dalla modificazione i dell ll enzima stesso L inibizione non competitiva e la combinazione di diverse inibizioni sono il problema più serio per l applicazione sintetica di enzimi, perché sono problemi che non possono essere risolti per semplice aumento della concentrazione del substrato. Enzimi isolati vs cellule La forma in cui vogliamo usare un certo enzima dipende da molti fattori quali: 1) tipo di reazione, 2) possibilità di riciclo del cofattore; 3) scala in cui si effettua la reazione.

12 Enzimi isolati vs cellule Enzimi isolati vs cellule

13 Enzymation: biotrasformazioni microbiche di substrati complessi che utilizzano alcuni o solamente un passaggio sintetico per convertire prodotti non naturali nei prodotti desiderati. Coenzimi Molecole a basso peso molecolare, Da, piuttosto delicate e decisamente costose per essere usate in quantità stechiometriche Devono quindi essere riciclate Riciclo necessario (+) o non necessario (-). Riciclo facile (++) o complesso (±)

14 Fonti di Enzimi La maggior parte degli enzimi usati nelle biotrasformazioni sono usati nella forma non purificata e quindi sono relativamente economici. Il contenuto varia (1-30%) e la forma non purificata è generalmente nt più stabile. Si ottengono: Industria della detergenza (lipasi e proteasi) Industria alimentare (proteasi e lipasi per la lavorazione della carne, formaggio, grassi e olio. Per le fermentazione e la cottura di dolci e pane vengono usate delle glicosidasi Isolamento da organi (fegato, reni) Processi di fermentazione da batteri o funghi Origine vegetale (piante o frutti) abbastanza rari Gli enzimi purificati sono molto costosi. Esistono però mezzi di purificazione sempre più efficaci ed economici.. Reazioni di Idrolisi Trasformazioni idrolitiche di esteri e ammidi (proteasi, esterasi, lipasi) Vantaggi: assenza di cofattori sensibili, disponibilità di un largo numero di enzimi non altamente specifici. Ampio utilizzo in sintesi organica (2/3 delle biotrasformazioni) Meccanismi i e aspetti cinetici i

15 Meccanismo di idrolisi enzimatica di ammidi e esteri Attacco nucleofilo da parte di un gruppo attivo dell enzima alla gruppo carbonilico dell estere o ammide (idrolisi basica) Gruppo attivo: -OH (serina) esterasi di fegato di maiale, lipasi microbiche -COO - (acido aspartico) pepsina -SH (cisteina) papaina Meccanismo serina idrolasi Meccanismo serina idrolasi

16 Idrolisi di proteine enzima catalizzata istidina serina Acido aspartico Enzima Chimotripsina (serina proteasi) Substrato Complesso Enzima-Substrato

17 Nuovo peptide N-terminale Intermedio tetraedrico

18 In ambienti con basse concentrazioni di acqua altri nucleofili competono con l acqua: Acil transfer: reazione di un altro alcol (trans-esterificazione) Amminolisi: reazione di RNH 2 (ammide N-sostituita) Reazione con H 2 O 2 (peracidi, RCOOOH) Reazione con tioli (tioesteri) non avviene Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali)

19 Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Si genera un nuovo stereocentro grazie alla tautomeria cheto enolica

20 Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Reagisce preferenzialmente uno dei gruppi enantiotopici Si genera una nuova unità stereogenica Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Processo ad uno stadio (diesteri) Idrolisi dell diestere dell acido malonico α,α-disostituito ad opera dell α-chimotripsina o dell esterasi di fegato di maiale (PLE) La reazione si ferma dopo l idrolisi del primo gruppo poiché il prodotto è fortemente idrato in ambiente acquoso e non viene più accettato dall idrolasi Cosa accade se la reazione procede? (seconda idrolisi)

21 Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Processo a due stadi (diacetato) Il prodotto di mono-idrolisi, monoacetato, è meno polare per cui si ottiene anche il secondo processo che porta nuovamente ad un prodotto achirale. La velocità però è inferiore (processo meno favorito) quindi si può recuperare il monoestere chirale ad elevati ee Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Composti meso (meso-trick)

22 Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Composti meso (meso-trick) Processo a doppio stadio, diacetato Cinetiche processi a singolo stadio (reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile) Selettività S= substrati achirale con gruppi enantiotopici o composto meso P,Q= prodotti enantiomerici L ee dipende dal rapporto k 1 /k 2, che è costante nel corso di tutta la reazione Quindi l ee non varia al variare della conversione, è costante

23 Cinetiche processi a doppio stadio (reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile) Il secondo processo è una risoluzione cinetica. Solitamente la selettività dell enzima è la stessa, per cui se k 1 >k 2 k 4 sarà maggiore di k 3. Con la conversione si otterrà un aumento nell ee del prodotto, mentre la resa in prodotto diminuisce Conversione Cinetiche processi a doppio stadio (reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile) Resa chimica dipende da: Selettività dipende da: Per avere alte rese in prodotto [Q+P] Per avere alte stereoselezioni in prodotto [P]

24 Cinetiche processi a doppio stadio (reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile) Enzimi come Biocatalizzatori PLE pig liver esterase, PPL porcine pancreatic lipase Cambiando enzima si ottiene opposta stereoselezione (ee PLE = 42%, ee PPL =89%) La risoluzione cinetica aumenta l ee

25 Risoluzione cinetica Primo esempio riportato risale al 1903 Nelle bio-trasformazioni le risoluzioni cinetiche sono 4 volte più frequenti delle trasformazioni stereoselettive Risoluzione cinetica Resa massima teorica: 50% In alcuni casi k S >>k R, si trasforma solo uno dei due enantiomeri Cinetiche di risoluzioni enzimatiche (Sih) Selettività di una risoluzione = E = Enatiomeric Ratio Eutomero: enantiomero con la massima reattività Distomero: enantiomero con bassa reattività o indesiderata

26 Risoluzione cinetica enzimatica Costanti cinetiche sono difficili ili da misurare Si preferisce utilizzare gli ee e la conversione

27 Dipendenza del valore di ee contro la conversione Processo di risoluzione enzimatica a due stadi I stadio: la reazione viene bloccata al 40% per il quale il prodotto ha un ee/resa massimizzata (vicini al punto X) II stadio: il substrato viene idrolizzato nuovamente fino ad una conversione complessiva del 60%, con un recupero di reagente ee/resa ottimale. Si sacrifica il 20% di prodotto

28 Processo di risoluzione enzimatica reversibile L ee del substrato varia ha un profilo diverso rispetto a quello delle reazioni irreversibili. Ad alti livelli di conversione la reazione inversa diventa più importante. Ovviamente sarà lo stesso enantiomero a reagire preferenzialmente, portanto ad una diminuzione dell ee globale del substrato. Per cui si deve operare in condizioni in cui la reazione sia irreversibile (per esempio aumentando la concentrazione del nucleofilo)

29 Risoluzione biocatalitica sequenziale Il substrato racemo ha due siti di reazione uguali, per cui la reazione procede due volte con la formazione di un mono estere intermedio In pratica il substrato deve coordinarsi al sito attivo e reagire due volte Si ottengono selettività molto alte Etot rappresenta la selettività che un singolo processo dovrebbe avere per ottenere questi ee

30 Risoluzione enzimatica sequenziale: idrolisi - esterificazione Meccanismo L acetato racemo A e B viene idrolizzato per dare gli alcoli P e Q in un mezzo organico contenente il minimo quantitativo di acqua. Per cui, per azione della stessa lipasi, si ha l esterificazione degli alcoli P e Q ad opera dell acido cicloesanoico presente nella miscela di reazione.

31 Il processo avviene quindi due volte con un notevole incremento della stereoselezione del processo Nel caso specifico si ottiene una E apparente =400 utilizzando processi che hanno E 1 =8 (idrolisi) e E 2 =97 per l esterificazione di P/Q con l acido cicloesanoico Deracemizzazioni Risoluzione cinetica: svantaggi -Massima resa del 50%. Scarsa importanza dell enantiomero non voluto -Separazione del substrato dal prodotto può essere complessa e costosa -Eccesso enantiomerico dei prodotti non ottimale Per evitare questi svantaggi si possono utilizzare varie strategie: Risoluzione Ripetuta Inversione in-situ Risoluzione Dinamica

32 Risoluzione Ripetuta L enantiomero non voluto (distomero), dopo separazione, viene racemizzato e riutilizzato nel successivo ciclo di risoluzione cinetica Approccio importante in processi industriali (sistemi in continuo) Conversione totale nel prodotto voluto (virtuale) Ciclo Eutomero (%) Distomero (%) Dopo 4 cicli teorica resa del ca 94% Rese reali più basse a causa delle condizioni energiche richieste per la racemizzazione Uso di racemasi Racemasi In generale riescono a racemizzare: -sistemi che contengono stereocentri con un protone -sistemi nei quali il protone è vicino ad un gruppo elettron attrattore ammino acidi H 2 N H R COOH HO H R COOH α-idrossiacidi, Classificazione in base ai siti basici nel sito attivo

33 Enzimi one-base (alanina racemasi) Richiedono il piridossil fosfato (PLP) come cofattore Racemasi e relativi substrati

34 Inversione in-situ Utilizzabile con molecole che contengono un singolo stereocentro. A seguito di una risoluzione cinetica il reagente e il prodotto vengono ottenuti ti nelle due forme enantiomeriche. nti i Il reagente o il prodotto, opportunamente modificato, viene trasformato mediante un processo stereospecifico, portando ad un derivato del prodotto o del reagente con la stessa configurazione assoluta. Esempio: idrolisi di esteri In una reazione di idrolisi, l alcol che si ottiene viene trasformato in tosilato o triflato che viene poi idrolizzato con inversione di configurazione. Nelle stesse condizione l estere a opposta configurazione viene idrolizzato con ritenzione di configurazione

35 Inversione in-situ Poiché ee S e ee P dipendono dalla conversione, la conversione deve essere calcolata in funzione del valore di E (usualmente intorno al 50%) Risoluzione Dinamica La risoluzione avviene in condizioni nelle quali il substrato racemizza rapidamente. Diverse reazioni avvengono contemporaneamente: L enzima deve avere un elevata specificità per uno degli enantiomeri (k S >>k R o k R >>k S S) ). L idrolisi non catalizzata deve essere trascurabile La racemizzazione del substrato deve avvenire a velocità uguali e maggiori della reazione enzimatica (k Sub rac k R o k S ) al fine di consentire concentrazioni sufficienti di enantiomero buono La racemizzazione del prodotto deve essere trascurabile

36 Risoluzione Dinamica diminuzione di ee P a causa delle risoluzione cinetica Risoluzione Dinamica con la risoluzione dinamica si possono ottenere elevati valori di ee P solo per elevate stereoselezioni E=19 ee P =90%; E=40 ee P =95%; E=100 ee P =98%

37 Idrolisi del legame ammidico Idrolisi del legame ammidico L idrolisi delle ammidi è naturalmente legato al mondo dei peptidi e ammino acidi Produzione mondiale superiore ai 0.5 milioni di tonellate Ammino acidi più importanti: Acido L-glutammico L-lisina i DL D,L-methionina i Prodotti per fermentazione o per via sintetica

38 Idrolisi del legame ammidico Ammino acidi D e L vengono prodotti con metodi enzimatici Mercato globale USA 2004: 4.5 miliardi di USD Applicazioni ammino acidi Idrolisi del legame ammidico Metodi più importanti per la produzione di ammino acidi Risoluzione di substrati racemi via idrolisi con proteasi, esterasi e lipasi: metodo più usato perché facile ed economico

39 Criteri generali Idrolisi del legame ammidico Generalmente il substrato con configurazione L viene accettato dall enzima e trasformato mentre il D non reagisce e viene recuperato dal mezzo di reazione. Se l enantiomero D è il prodotto desiderato lo si può ottenere utilizzando opportuni gruppi protettori. Con opportuni enzimi (idantoinasi) sono disponibili anche enzimi che accettano preferenzialmente l enantiomero D. I due enantiomeri si separano agevolmente sfruttando le diverse caratteristiche del reagente e del prodotto, per esempio solubilità a diversi ph. Questo consente la separazione via estrazioni o cromatografie con resine a scambio ionico. Generalmente questi enzimi accettano solo ammino acidi α-sostituiti Idrolisi del legame ammidico Produzione di D e L ammino acidi con acilasi. Utilizzato per L-metionina, L-valina, acido L-α-amino butirrico, D-fenil alanina

40 Risoluzioni con acilasi Idrolisi del legame ammidico Risoluzioni con idantoinasi Idrolisi del legame ammidico Utilizzato per L-metionina, L-serina, D-ammino acidi aromatici (D-fenil glicina, p-idrossi-d-fenilglicina)

41 Risoluzioni con lattamasi Idrolisi del legame ammidico Idrolisi di Esteri -Criteri generali Idrolisi di esteri Esistono molte poche esterasi che possono essere utilizzate per l idrolisi di esteri. Tra queste particolarmente importanti sono la PLE (pig pg liver esterase) ) HLE (horse liver esterase) ) e la ACE (acetilcoline esterase) ) estratta dall anguilla elettrica. Possono essere anche utilizzare le cellule microbiche, ma questo limita la variazione delle condizioni di reazione. Ampi screening per individuare nuove esterasi e per esprimerle in microorganismi ospiti sono in corso Fortunatamente t t per queste reazioni i possono essere utilizzare anche le proteasi. Le più utilizzate sono la α-chimotripsina e la subtilisina. Vengono anche utilizzate, anche se in modo minore, la tripsina, pepsina, papaina e la penicillina acilasi In generale vengono idrolizzati gli esteri che mimano la configurazione di un amminoacido L

42 Substrato tipo per esterasi e proteasi Idrolisi di esteri Idrolisi di Esteri Regole generali Idrolisi di esteri Per entrambi i tipi di esteri lo stereocentro deve essere collegato il più possibile vicino al centro reattivo per assicurare un riconoscimento chirale massimo. I gruppi R 1 e R 2 possono essere gruppi arilici o alchilici o sistemi ciclici, ma la loro differenziazione sterica deve essere massimizzata. Non devono essere presenti gruppi carichi o polari (COOH, CONH 2, NH 2 ) che sono fortemente idratati in ambiente acquoso. Per cui devono essere opportunamente protetti. Per i substrati di tipo I la funzione alcolica l R 3 deve essere la più piccola possibile (Me, Et). Questo vale anche per quelli di tipo II (acetati o propionati). In tutti i casi deve essere presente un protone legato allo stereocentro.

43 Principali usi degli enzimi nelle biotrasformazioni Principali enzimi usati nelle biotrasformazioni

44 Lipasi Lipasi Le lipasi sono enzimi che idrolizzano trigliceridi nei corrispondenti acidi grassi e glicerolo. Giocano un importante ruolo nelle biotecnologie poiché vengono utilizzati in processi alimentari e per la preparazione di intermedi chirali. Più del 35% delle bio-trasformazioni vengono effettuate con lipasi e per questo le lipasi sono gli enzimi più studiati. Sono state clonate più di 30 lipasi e sono state risolte le strutture di 12 lipasi. Il meccanismo con cui idrolizzano funzioni esteree è differente da quello delle esterasi Lipasi e Esterasi: cinetiche Lipasi Differente interazione fisico chimica con il substrato: l enzima non mostra attività finché il substrato è sciolto nel solvente in forma monomerica. Quando la concentrazione aumenta tanto da formare una seconda fase (lipofilica), si ottiene un brusco innalzamento della reattività. Attivazione all interfaccia: origina dal fatto che il sistema diventa attivo solo quanto la concentrazione del substrato raggiunge la CMC (concentrazione micellare critica)

45 Attivazione all interfaccia: la spiegazione a livello molecolare del fenomeno è stato visto derivare da un riarrangiamento dell enzima: l enzima in fase acquosa è inattivo poiché una sua parte copre il sito attivo [Enz]. a contatto con la fase-bifasica un piccolo peptide in α-elica si allontana e scopre il sito attivo e la lipasi si riarrangia nella forma attiva [Enz]. Per cui idrolisi catalizzare da lipasi devono essere condotte in mezzi bifasici. Il substrato può essere usato come tale o dissolto in solventi organici immiscibili con l H 2 O (esano, etere etilico, toluene). Fenomeni di trasferimento di massa (per esempio agitazione) influenzano notevolmente la reattività del sistema (rese in prodotto) Per determinare l attività di una lipasi si utilizzano triacilgliceroli quali la trioleina e tributilina mentre per le esterasi si utilizza il p-nitroacetato O O O CO CO CO R R R lipasi OH OH OH + 3 R-COOH R=????? H 2 C O O NO 2 esterasi O + H 2 C OH HO NO 2 Co-solventi miscibili con l acqua attivano le esterasi mentre co- solventi immiscibili attivano le lipasi

46 Le lipasi sono sono state maggiormente utilizzate in risoluzioni piuttosto che con composti meso, e con derivati di alcoli chirali, vista la natura dei substrati naturali In generali le stereoselezioni sono più elevate quando lo stereocentro è vicino alla funzione carbossilica e in presenza di un protone, (analogamente alle esterasi) Criteri generali Per substrati di tipo III la catena R 3 deve essere sufficientemente lunga (3,4 atomi di C) per conferire sufficiente lipofilicità al substrato. D altro canto catene troppo lunghe portano a substrati con punto di ebollizionetroppo alto e alla formazione di schiume e emulsioni. n-butanoati sono normalmente gli esteri prescelti Usualmente vengono idrolizzati preferibilmente substrati con configurazione R allo stereocentro alcolico. Molte proteasi (α-chimistripsina, subtilisina) mostrano stereoselezioni opposte. Nelle strutture risolte ai raggi x si è osservato che la disposizione della triade catalitica è invertita nelle due classi di idrolasi. Questa potrebbe essere l origine dell opposta stereoselezione.

47 Criteri generali Per substrati di tipo IV il residuo R 3 dell alcol deve essere preferenzialmente una catena alifatica lunga (n-butanolo). Per qyesti substrati si è osservata una preferenza nell idrolisi di esteri S. Funghi e batteri producono un elevato numero di lipasi. Poiché sono enzimi extracellulari possono venire prodotti in elevate quantità su larga scala. Spesso vengono prodotti due isoenzimi (A e B), che sono strettamente correlati. Solitamente mostrano la stesso senso di stereoselezione, ma in alcuni casi si notano diversi valori di stereoselezione. Estratti di lipasi usualmente contengono entrambe le forme. La loro attività dipende dal quantitativo di enzima presente nella preparazione e anche dal fornitore.

48 Source Mammalian Fungal Bacterial Name Human Pancreatic Lipase Horse Pancreatic Lipase Pig Pancreatic Lipase Guinea Pig Pancreatic Lipase Rhizomucor meihei Pencillium cambertii Humicola lanuginosa Rhizopus oryzae Candida rugosa Candida antarctica Lipase A, Lipase B Aspergillus niger Geotrichium candidum Chromobacterium viscosum Pseudomonas cepacia Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fragi Bacillus thermocate nulatus Staphylococcus hyicus Staphylococcus aereus Brand Name Lipopan Lipozyme Novozym Palatase TM Clear-Lens TM LIPO Greasex Lipolase TM LipoPrime NovoCor TM AD Novozym 735 Novozym 871 Main Application Baking industry Oils and fats industry Pasta/Noodles Dairy industry Personal care industry Leather Detergent industry Detergent industry Leather industry Textile industry Pet Food Industry

49 Requisiti Sterici per le Lipasi Le lipasi più utilizzate possono essere classificate sulla base delle caratteristiche del substrato naturale Lipasi di Pancreas Suino (PPL) E la lipasi più economica e quindi più utilizzata. L estratto crudo contiene una serie di altre idrolasi oltre alla PPL (la forma parzialmente purificata è commerciale ad un prezzo molto più alto). L estratto commerciale che contiene ca 5% di PPL viene chiamato pancreatina o steapsina. Contiene anche altre idrolasi (α- chimotripsina, colesterol esterase, carbossipeptidasi B, fosfolipasi) per cui la reattività osservata può originare dalle diverse specie. PPL è particolarmente attiva nell idrolisi di esteri primari mentre α- chimotripsina e colesterol esterase sia con esteri di alcoli primari che secondari.

50 Idrolisi asimmetrica di derivati meso con PPL Risultati complementare con l idrolisi catalizzata da PLE Ee maggiori con modificazioni del substrato sintesi di prostaglandine carbacicliche trattamento della trombosi Idrolisi asimmetrica di gliceroli con PPL 1,3-propandioli achirali come substrato (fattori stereo-elettronici) elettronici) Migliori risultati con sistemi bifasici

51 Risoluzione di acetati biciclici Reattività delle diverse idrolasi contenute nel PPL L elevata selettività è dovuta ad una nuova idrolasi isolata dal estratto di PPL Candida sp. Lipasi Sono disponibili diverse lipasi da lieviti tipo Candida. I più utilizzati sono quelli di Candida lipolitica, C. antartica e C. rugosa. Lipasi di Candida rugosa Sono principalmente attivi con esteri di alcoli secondari ciclici + veloce

52 Modello del Substrato per Lipasi di C. Rugosa L estratto di CRL occasionalmente manifesta scarsa selettività con esteri α-sostituiti. Questo è attribuibile alla presenza di due forme isomeriche dell enzima che operano con differenti selettività anche se hanno la stessa enantiopreferenza Forma A più selettiva e stabile

53 Modificazioni non covalenti di Lipasi di C. Rugosa (trattamento con i-proh) Il semplice trattamento con i-proh acquoso (50%) porta ad una lipasi modificata che mostra un considerevole aumento di attività e stereoselezione Lipasi di Candida antartica Questi enzimi sono stati trovati in Antartico nel corso di uno screening effettuato per ottenere lipasi che operassero in condizioni estreme da usare in formulazioni per la detergenza I due isoenzimi sono abbastanza diversi: isoenzima A: Ca 2+ dipendente, termostabile, molto stabile con trigliceridi in modo non specifico, non molto utile per sistemi non naturali. isoenzima B: non è Ca 2+ dipendente, meno termostabile, attivo con un largo numero di substrati non naturali. Entranbi sono stati clonati e sovraespressi in Aspergillus oryzae e sono disponibili in larghe quantità

54 Tipici substrati per lipasi di Candida antartica Meccanismo di Reazione della CALB

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57 Meccanismo di Racemizzazione di alcoli ad opera di complessi di Ru