Biotecnologie nella produzione di ingredienti vegetali

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1 Articoli Biotecnologie nella produzione di ingredienti vegetali Estratto di Ajuga reptans titolato in Teupolioside Roberto Dal Toso R&D Director, Istituto di Ricerche Biotecnologiche (IRB), Altavilla Vicentina, Vicenza Francesca Melandri Product Development, Istituto di Ricerche Biotecnologiche (IRB), Altavilla Vicentina, Vicenza Parole chiave Biotecnologie Colture cellulari vegetali Ajuga reptans Teupolioside Analisi metabolomica INTRODUZIONE Il mondo vegetale è da sempre una fonte inesauribile di principi medicamentosi per l uomo, mettendo a disposizione preziose sostanze biologicamente attive. A tutt oggi i principi attivi e i prodotti di origine vegetale utilizzati sono molteplici non solo in ambito farmaceutico, ma anche nel settore nutrizionale e, più in generale, nell area della salute. Infatti la diffusione e il consumo di prodotti fitoterapici ed integratori alimentari di origine vegetale nella comune dieta hanno raggiunto un livello tale nella popolazione da determinare un esposizione significativa dal punto di vista della salute pubblica e diventare pertanto oggetto di interesse delle autorità ufficiali di controllo di tutto il mondo. Tuttavia allo stato attuale gli standard di sicurezza, disponibilità e purezza degli estratti vegetali, nonostante gli sforzi della maggior parte delle aziende, tesi a garantirne la qualità attraverso un incremento quali-quantitativo dei controlli, per la stessa natura del processo produttivo non possono dichiararsi immuni da possibili contaminazioni e variazioni del titolo. Opportunità interessanti derivano dall utilizzo della tecnologia delle colture di cellule o tessuti vegetali, una tecnica nota da tempo in ambito scientifico, ma che finora non era mai stata sviluppata su scala industriale per la produzione di estratti vegetali. Questo processo non solo è in grado di assicurare qualità e sicurezza superiori ed un profilo di composizione riproducibile del prodotto finito, ma, operando nel pieno rispetto dell ambiente, permette il completo affrancamento da variazioni geografiche, climatiche o stagionali ed assicura una produzione programmabile e flessibile. Recentemente è stato sviluppato il primo ingrediente ad uso alimentare prodotto con la tecnologia delle colture di cellule vegetali: l estratto secco di Ajuga reptans titolato in teupolioside*. Si tratta del primo estratto vegetale di origine biotecnologica autorizzato in Europa quale ingrediente di integratori alimentari che ha dimostrato promettenti prospettive di applicazione in problematiche ancora irrisolte nell area gastro-intestinale. Problematiche di produzione Sicurezza Uno studio del 2006, condotto dalla California Food Guide (Chapter 26 Environmental Contaminants of Food), ha sottolineato il rischio cui sono esposti i consumatori per la presenza di contaminanti ambientali in alimenti, tra cui metalli pesanti quali piombo e mercurio, sostanze chimiche (pesticidi, idrocarburi poliaromatici e difenili clorurati) cui vanno aggiunte contaminazioni biologiche (insetti, funghi, infestanti) dovute a tecniche colturali approssimative, trasporti su lunghe distanze e modalità di conservazione inadeguate. Tra il 1999 ed il 2001, grazie al National Health and Nutrition Examination Survey, sono stati individuati più di 140 contaminanti ambientali, o loro metaboliti, nei prelievi ematici ed urine dei soggetti partecipanti. Lo studio si poneva come obiettivo la rimozione di tutti i contaminanti noti dai prodotti alimentari e dai loro processi di preparazione (1). Esaminando nello specifico la situazione dei prodotti di origine vegetale, è importante citare un documento del 2003 dell Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA), in cui si riconosce che i botanicals presentano tuttora numerosi problemi, legati in particolare alla sicurezza e alla qualità. La contaminazione ambientale, chimica e microbiologica, è infatti ampiamente documentata e recentemente è stata associata, per esempio, a prodotti vegetali provenienti dall Asia. *Teoside prodotto da Istituto di Ricerche Biotecnologiche (IRB, Altavilla Vicentina) 17

2 Altri fattori da considerare sono l adulterazione con farmaci di sintesi ed errori nella identificazione della pianta che possono mettere seriamente in pericolo la salute del consumatore finale (2). intensificazione delle coltivazioni biologiche, l applicazione di rigorosi protocolli di raccolta, di stoccaggio e lavorazione delle materie prime vegetali e l aumento dei controlli a campione, nelle diverse fasi di produzione, hanno determinato notevoli miglioramenti in termini di sicurezza dei prodotti finiti, che tuttavia non sono comunque in grado di assicurare la totale assenza di agenti inquinanti o tossici. Qualità Un capitolo a parte è rappresentato dalla qualità dei prodotti di origine vegetale intesa per esempio come corrispondenza quali-quantitativa dei componenti vegetali con quanto dichiarato in etichetta. Da un indagine effettuata su alcuni integratori alimentari a base di Echinacea (E. angustifolia, pallida, purpurea) regolarmente in commercio negli Stati Uniti è emerso che solo il 52% dei campioni conteneva effettivamente le specie dichiarate, mentre una verifica analoga condotta nel 2004 ha riscontrato, sempre per preparazioni a base di Echinacea, un intervallo di variazione dei livelli del marker di riferimento del % rispetto alla quantità dichiarata in etichetta, con considerevoli differenze quindi nella dose giornaliera di marker effettivamente assunto (3,4). Questi studi registrano i tratti caratteristici di una situazione complessa, dipendente da variabili numerose e difficilmente controllabili, ma con implicazioni potenzialmente rilevanti soprattutto, e non solo, sulla salute del consumatore finale, ma anche sulla reputazione delle aziende che commercializzano questa classe di prodotti. Le variabili ambientali rappresentano un considerevole ostacolo nel garantire il rispetto degli standard di qualità e purezza degli estratti vegetali, non sempre verificabili data l assenza, in molti casi, dei marker di riferimento. A questi standard è però correlata l attività biologica rivendicata in quanto l efficacia di un estratto vegetale è generalmente associata ad uno o più metaboliti secondari, sostanze sintetizzate dalle piante in risposta a fattori biotici ed abiotici di vario tipo con funzione di difesa e protezione dalle aggressioni esterne, siano esse meccaniche, fisiche (esposizione a raggi UV) o biologiche (attacco di microrganismi) (5,6). Pertanto il profilo e la concentrazione dei metaboliti secondari prodotti dalle piante dipendono fortemente dalle condizioni ambientali e di crescita della pianta che risultano però intrinsecamente variabili. La composizione del terreno, inclusa la microflora, le condizioni climatiche, le variazioni stagionali e, non ultimo, il trattamento con sostanze chimiche, sono tutti fattori che incidono sul contenuto di metaboliti secondari, cui si aggiunge infine la scarsa uniformità genetica del materiale vegetale (7,8). Nonostante gli sforzi messi in atto per ottenere estratti rispondenti agli standard di qualità prefissati, applicando rigorosi protocolli di coltivazione e di estrazione, non sempre economicamente sostenibili, il controllo delle condizioni ambientali non può essere totale. Disponibilità Numerosi fattori, molti dei quali poco controllabili, hanno impedito all uomo di usufruire delle utili proprietà delle sostanze di origine vegetale e tanto più di soddisfare le crescenti richieste del mercato. In primo luogo per il limitato contenuto di principi attivi nei tessuti vegetali, che obbliga quindi a lunghe e poco sostenibili, economicamente ed ecologicamente, procedure di purificazione con utilizzo esteso di solventi ad elevato impatto ambientale. Inoltre molti principi attivi di interesse si trovano in piante situate in aree geografiche difficilmente raggiungibili o vengono prodotte da piante rare o appartenenti a specie protette, la cui raccolta è strettamente regolamentata. Secondo alcuni esperti centinaia di piante medicinali sono a rischio di estinzione a causa della raccolta indiscriminata e della deforestazione (9). La reperibilità della pianta è legata anche a fattori intrinseci quali il ciclo biologico ed il tempo balsamico della pianta. Infine è necessario considerare anche la degradazione del principio attivo in fase di stoccaggio e trasporto sia della pianta che dell estratto. LA TECNOLOGIA DELLE COLTURE DI CELLULE E TESSUTI VEGETALI La crescita in coltura (fermentazione) di organismi viventi è un processo ampiamente utilizzato su scala industriale per la produzione di materie prime ad alto valore aggiunto, quali l acido citrico, l acido ascorbico e l acido lattico che si ottengono da fermentazione batterica. Ancora più antico nella storia dell uomo è l utilizzo del fermentato batterico o fungino (lieviti) per la trasformazione di alimenti, come nel caso di pane, vino, birra, formaggi e yogurth (fermenti lattici). 18 Le basi teoriche La tecnologia delle colture di cellule vegetali è l insieme dei modi e metodi utilizzati per crescere cellule vegetali, tessuti e organi in un mezzo nutriente ed in assenza di microrganismi. Le basi teoriche della tecnologia sono note ormai da tempo ma la loro applicazione è stata finora limitata agli ambienti accademici in quanto si tratta di una via assai impegnativa dal punto di vista economico per gli elevati costi richiesti per la ricerca, lo sviluppo e la conduzione di uno scale up di tipo industriale (10). Il suo sviluppo a livello industriale è stato infatti finora riservato a molecole complesse la cui sintesi risulta particolarmente difficile: il tassolo, farmaco antitumorale inizialmente ottenuto per estrazione dalle bacche e dagli aghi della pianta Taxus brevifolia ed ora prodotto esclusivamente per via biotecnologica, rappresenta un esempio di soluzione ottimale che ha consentito di superare il prowww.ceceditore.com , 12(2)

3 blema del lento ciclo di crescita della fonte vegetale. Questa tecnologia permette dunque di produrre le stesse sostanze bioattive presenti nella pianta e spesso costituisce l unica fonte alternativa disponibile, senza limiti quantitativi, per la produzione di quei principi attivi difficilmente reperibili in natura o di difficile produzione per sintesi chimica. Queste caratteristiche sono state ben evidenziate anche dalla FAO (Organizzazione delle Nazioni Unite per il Cibo e l Agricoltura) che, già in un documento del 1994, proponeva le colture di tessuti e cellule vegetali come un processo biotecnologico utilizzabile per la produzione di sostanze e metaboliti, come gli additivi alimentari (11). Il principio biologico su cui si basa la tecnica delle colture di cellule e tessuti vegetali è la presenza in tutte le piante superiori di una riserva di cellule staminali totipotenti, localizzate principalmente agli apici di accrescimento della pianta, cioè radici e gemme, in tessuti specializzati detti meristematici. Queste cellule meristematiche sono di piccole dimensioni, hanno nucleo sviluppato ed il citoplasma ricco di ribosomi e mitocondri, proprio in virtù della loro elevata capacità di rinnovamento e di generazione di cellule differenziate. In realtà questo potenziale meristematico è posseduto anche dai tessuti differenziati e può essere spontaneamente riattivato in determinate condizioni, come in caso di danneggiamento del tessuto vegetale, con conseguente assunzione da parte delle cellule di uno stato di tipo staminale (12,13). La generazione di una linea cellulare vegetale non è altro che un processo artificiale di risveglio di questo potenziale meristematico in un tessuto adulto, che viene ottenuto operando delle incisioni nei tessuti delle piante. Il danno meccanico inferto induce la generazione di un tessuto di riparazione, noto come callo, che risulta costituito da aggregati di cellule indifferenziate, non organizzate e in rapida proliferazione (cellule meristematiche). In presenza di un adeguato supporto nutritivo, il callo può crescere indefinitamente in coltura e da esso poi, mediante opportuni stimoli di tipo ormonale, è possibile generare nuovamente un organismo vegetale maturo. Il processo operativo Il primo passo per l ottenimento di una nuova linea cellulare vegetale è quello di sterilizzare il tessuto della specie vegetale che si desidera utilizzare. Questo è un passaggio fondamentale molto critico: da un lato è necessario per rimuovere dal tessuto vegetale tutti i microrganismi (batteri, funghi e muffe), che potrebbero contrastare o impedire lo sviluppo della coltura vegetale; dall altro rischia di devitalizzare irrimediabilmente il tessuto inibendo quella risposta biologica che è all origine di ogni nuova linea cellulare. Si utilizzano pertanto sostanze antisettiche delicate, quali etanolo ed ipoclorito di sodio, unitamente a blandi tensioattivi per favorire una maggiore penetrazione nei tessuti. Il tessuto vegetale sterilizzato viene successivamente tagliato in frammenti minuti (espianti) e depositato in piastre Petri contenenti terreno nutritivo solido, addizionato di ormoni vegetali ed in assenza di antibiotici (Fig 1,2). Nonostante la procedura di sterilizzazione, gran parte degli espianti risulterà ancora inquinata e dovrà essere eliminata. Solo da una piccola percentuale degli espianti inizialmente posti in coltura, variabile a seconda del tipo di pianta e di tessuto utilizzato (5-30%), si osserva la spontanea generazione del tessuto cicatriziale calloso. La tecnica di induzione del tessuto calloso segue un protocollo collaudato solo in linea generale, in quanto adattamenti e aggiustamenti allo specifico genere di pianta e al tipo di tessuto utilizzato sono necessari e vengono dettati per lo più dall esperienza pratica (Fig 3). Figura 1 Prelievo del tessuto vegetale sterilizzato Figura 2 Deposito degli espianti in coltura solida 19

4 La crescita ed il mantenimento dei calli vengono assicurati dal regolare trasferimento su uno specifico terreno colturale contenente tutte le sostanze necessarie al metabolismo cellulare, primo fra tutte una fonte di carbonio organico, in genere saccarosio, in quanto le cellule in coltura, mantenute al buio, perdono la capacità fotosintetica e si comportano come organismi eterotrofi. Devono essere forniti anche ormoni vegetali (auxine e citochinine), alcune vitamine, macroelementi e microelementi inorganici (14). Variando opportunamente la composizione del terreno di coltura è possibile selezionare nel tempo linee cellulari con le caratteristiche biochimiche e metaboliche più vantaggiose: con ripetuti passaggi, vengono mantenuti in coltura solo gli aggregati di tessuto calloso più friabili, con elevata velocità di crescita e con maggiore contenuto di metaboliti di interesse, ottenendo infine linee cellulari con caratteristiche stabili ed omogenee (Fig 4). Tale procedura consente di dare origine ad una linea di cellule vegetali non OGM in quanto non viene attuato alcun intervento di ingegneria genetica per modificare il genoma vegetale, ma si tratta esclusivamente di una selezione effettuata sulla base di caratteristiche morfologiche e biochimiche. Al fine di salvaguardare i risultati raggiunti con questa impegnativa attività di ottimizzazione e limitare i problemi legati ad inevitabili fenomeni di senescenza, la linea cellulare selezionata viene congelata e conservata a lungo termine in azoto liquido. alta percentuale di acqua presente nella cellula vegetale rende particolarmente difficoltoso il congelamento; infatti è necessario evitare la formazione di cristalli di ghiaccio, dopo l immersione in azoto liquido, che non permetterebbero alle cellule di sopravvivere e di ricrescere una volta piastrate su terreno solido. Per queste ragioni la tecnica di criopreservazione richiede un grado di esperienza notevole nella coltura delle cellule vegetali: infatti, non esistendo una procedura collaudata, le specifiche condizioni operative vanno messe a punto per ogni singola linea cellulare. Il passaggio essenziale per conseguire l industrializzazione del processo produttivo è l adattamento alla crescita in terreno liquido della linea cellulare selezionata, in quanto permette un aumento notevole della biomassa disponibile. Le colture in sospensione vengono gradualmente adattate alla crescita in bioreattori di capacità sempre maggiore (scale up) e mantenute in regolare agitazione per consentire un adeguato scambio gassoso, necessario al metabolismo cellulare. In questa fase è determinante la definizione, non solo della composizione del terreno, ma anche dei parametri di fermentazione quali ossigenazione, temperatura, modalità e velocità di agitazione, che vanno adattati ad ogni singola linea cellulare. Alla fine del ciclo di fermentazione la biomassa espansa in coltura liquida in bioreattore viene omogenizzata per rompere le pareti cellulari e consentire la fuoriuscita dei metaboliti secondari immagazzinati nei compartimenti interni delle cellule. Il filtrato viene poi estratto per concentrare le sostanze di interesse fino ad ottenere un prodotto finale in forma di polvere. I vantaggi Le cellule vegetali, selezionate e coltivate in fermentatori sterili su scala industriale, costituiscono dei veri e propri vivai di sostanze vegetali che offrono numerosi vantaggi rispetto all utilizzo di queste sostanze da pianta coltivata in campo aperto. Innanzi tutto si esclude la presenza di sostanze tossiche, quali erbicidi, pesticidi, metalli pesanti ed altri inquinanti ambientali, in quanto la coltura avviene in condizioni sterili ed in assenza di trattamenti antibiotici. Inoltre il rigoroso controllo delle condizioni colturali e la continua attività di selezione riducono notevolmente le variazioni spontanee e garantiscono un profilo di metaboliti secondari riproducibile, superando quindi il problema della variabilità legata alle condizioni climatiche e geografiche. La tecnologia consente anche il superamento del limite del ciclo biologico della pianta e della stagionalità dei metaboliti secondari, garantendo in ogni momento la Figura 3 Callogenesi Figura 4 Linea cellulare di Ajuga reptans in coltura solida 20

5 disponibilità dei costituenti del fitocomplesso vegetale. Anche le perdite per degradazione del principio attivo in fase di stoccaggio del materiale vegetale vengono drasticamente ridotte in quanto il processo di estrazione avviene immediatamente alla fine del ciclo di fermentazione della biomassa con minime perdite dei principi vegetali responsabili delle proprietà degli estratti. Il risultato finale è quindi la produzione, rapida, flessibile e senza limiti di quantità, di estratti con un profilo di sicurezza superiore e con una composizione altamente standardizzata. Ultimo, ma non meno importante, è il minore impatto ambientale di un processo biotecnologico che non modifica gli equilibri ecologici, in quanto si annulla la necessità di un continuo approvvigionamento di materiale vegetale per raccolta spontanea o sfruttamento intensivo dei terreni, ancora più critico in caso di piante a crescita lenta o appartenenti a specie protette. Infine, avendo la biomassa vegetale ottenuta per fermentazione una composizione molto semplice e concentrata nel metabolita di interesse, le procedure di estrazione risultano più semplici ed efficienti, con consistente riduzione dell utilizzo di solventi ad elevato impatto ambientale. dalla presenza di derivati polifenolici, quali l acido cinnamico e l orto-diidrossifeniletanolo, legati alla stessa molecola di β-glucopiranosio, rispettivamente con un legame estereo ed un legame glicosidico. Altre molecole saccaridiche, quali ramnosio, xilosio e apiosio sono spesso legate al glucosio che fa da ponte fra le due strutture aromatiche. I gruppi polifenolici più frequentemente legati al C-4 del glucosio sono l acido caffeico, l acido ferulico ed il cinnamico (15). Il contenuto di fenilpropanoidi nella pianta di Ajuga reptans è molto limitato e fortemente dipendente dalla stagione con il massimo livello presente in primavera e minimo durante l autunno e l inverno, secondo un andamento tipico dei metaboliti secondari. Nell Ajuga reptans sono stati isolati numerosi fenilpropanoidi, il più abbondante dei quali è il teupolioside, isolato per la prima volta nel 1991 da piante di Teucrium polium (16). Il teupolioside ha una struttura molto simile a quella dell echinacoside, la principale sostanza attiva presente negli estratti di Echinacea spp (Fig 6,7). Figura 6 Struttura chimica del teupolioside ESTRATTO DI AJUGA REPTANS TITOLATO IN TEUPOLIOSIDE Figura 5 Pianta di Ajuga reptans Ajuga reptans è una pianta erbacea annua appartenente alla famiglia delle Labiatae, tipica dei luoghi erbosi di Europa, Asia occidentale ed Africa (Fig 5). Conosciuta anche come bugola o erba mora o erba Lorenza, è comune nelle regioni temperate, soprattutto montuose, dove viene utilizzata come foraggio per i bovini. Fin dal Medioevo Ajuga reptans è stata usata in medicina popolare per curare ferite ed ulcerazioni, date le sue proprietà antiemorragiche, antinfiammatorie e cicatrizzanti, tanto che in Germania è stata ribattezzata come erba delle piaghe (Wundkraut). Gli estratti ottenuti dalle colture cellulari di Ajuga reptans sono caratterizzati dalla presenza di fenilpropanoidi, molecole naturali idrosolubili che appartengono alla categoria dei metaboliti secondari. Come già detto, queste molecole svolgono un importante funzione protettiva per il tessuto vegetale nei confronti degli stress ambientali e, proprio in virtù di questo ruolo sono dotati di importanti proprietà biologiche. Chimicamente, i fenilpropanoidi, spesso denominati anche feniletanoidi, sono caratterizzati Figura 7 Struttura chimica dell echinacoside 21

6 estratto secco di Ajuga reptans titolato in teupolioside è il primo ingrediente prodotto con la tecnologia delle colture di cellule vegetali ed autorizzato per uso alimentare. estratto secco di Ajuga reptans titolato al 50% in teupolioside, sul quale sono stati condotti gli studi, si presenta come una povere beige inodore. Le tipiche analisi di controllo qualità hanno evidenziato una carica microbica contenuta nei limiti standard previsti (batteri <1000 ufc/g e funghi <100 ufc/g) e la totale assenza di metalli pesanti, micotossine, quali aflatossina B, e l assenza di pesticidi ed erbicidi. Alle concentrazioni utilizzate per la sperimentazione, l estratto è facilmente solubile in acqua con un limite superiore misurato di circa 30 mg/ml. estratto di Ajuga reptans è risultato stabile per almeno 3 anni in polvere, mentre in soluzioni acquose la stabilità è fortemente dipendente dal ph. In soluzioni acquose con ph fisiologico o basico, a concentrazioni di 2 mg/ml, il teupolioside reagisce in modo veloce e completo con i radicali d ossigeno presenti in soluzione, scomparendo in pochi giorni. Viceversa in soluzioni acquose a ph < 5 o, meglio ancora, < 4, la stabilità del teupolioside aumenta notevolmente superando i 18 mesi. Attività biologica Le attività biologiche del teupolioside non sono ancora completamente chiarite per lo scarso contenuto nella pianta che lo rende difficile da ottenere in forma pura. Inoltre, la sua sintesi chimica è molto complessa e non economica. Per queste ragioni è piuttosto limitata la letteratura scientifica disponibile su questa molecola. Gli estratti da colture cellulari di Ajuga reptans hanno perciò costituito una fonte preziosa da cui ricavare preparazioni standardizzate di teupolioside con cui condurre le sperimentazioni. Attività antiossidante Gli estratti di Ajuga reptans sono stati valutati per la loro capacità antiossidante (radical scavenger) nei confronti di radicali d ossigeno (ione superossido e radicale idrossile) e d azoto (radicale perossinitrito). In prove eseguite con varie metodiche l attività antiossidante dell estratto di Ajuga reptans è risultata superiore sia all acido ascorbico (vitamina C) sia al trolox (derivato idrosolubile della vitamina E) sia alla rutina, un ben noto flavonoide, (17) che all aloina (Fig 8). Risultati analoghi, con elevata attività antiossidante dei fenilpropanoidi, sono stati ottenuti con un altro estratto da colture di cellule vegetali di Syringa vulgaris titolato al 50% in verbascoside (18). Attività antinfiammatoria Molti dati di letteratura riportano che i fenilpropanoidi, quale l acteoside noto anche come verbascoside, posseggono attività antinfiammatoria in una serie di test in vitro ed in vivo tra cui anche l inibizione dell enzima nitrossido sintasi inducibile (inos), l enzima responsabile della produzione di ossido nitrico (NO) nel corso di processi infiammatori. NO è riconosciuto in particolare come uno dei mediatori importanti, sia fisiologici per la regolazione del flusso ematico, sia infiammatori per l aumento della permeabilità vasale con conseguente edema e migrazione leucocitaria. Il controllo dei livelli di NO è perciò un fattore importante nello sviluppo del processo infiammatorio. azione inibitoria del teupolioside sull NO è stata verificata in vitro utilizzando una linea di macrofagi (RAW 264.7) che, stimolati da lipopolisaccaridi (LPS), producono elevate quantità di NO per induzione genica della inos. In presenza di concentrazioni tra 50 è 200 μg/ml di estratto di Ajuga reptans titolato in teupolioside il rilascio di NO, da parte delle cellule macrofagiche stimolate con LPS, risulta diminuito fino all 87% in modo statisticamente significativo (Fig 9). azione antinfiammatoria in vitro è stata anche verificata su colture primarie di cheratinociti umani stimolati con TNF-α per indurre il rilascio di Interleuchina 8 (IL-8), Figura 8 Attività antiossidante (radical scavenger) del teupoliosode (Teupo) da Ajuga reptans in confronto con rutina ed aloina Figura 9 Inibizione del rilascio di NO da macrofagi RAW da parte dell estratto di Ajuga reptans lc50 (μg/ml) Superossido Idrossile Perossinitrito Teupo Rutina Aloina % Produzione NO LPS 10 μg/ml ** A. reptans 50 μg/ml ** ** A. reptans 100 μg/ml (Student s t-test: n=6, **=p<0.01 vs LPS ) A. reptans 200 μg/ml 22

7 una potente chemiochina proinfiammatoria. Anche in questa sperimentazione concentrazioni tra 10 e 100 micromolare di teupolioside hanno ridotto il rilascio di IL-8 ai livelli del controllo (17). In vivo, l azione antinfiammatoria dell estratto di Ajuga reptans è stata recentemente confermata in roditori. In questo recente studio (18) si dimostra come la somministrazione orale di 0.07 mg/kg di estratti di Ajuga reptans sia in grado di inibire la risposta infiammatoria indotta dall iniezione intraperitoneale di 2.5 μg/animale di LPS in topi maschi CD1, in particolare riducendo i livelli ematici di TNF-α del 58% in modo statisticamente significativo (p<0.004) e del 87% i livelli ematici di lipoperossidi. Lo stesso studio documenta anche un azione di controllo del teupolioside, sempre somministrato per via orale, sull attività della 5-alfa-reduttasi, l enzima che trasforma il testosterone in diidrotestosterone ed implicato nella genesi di acne, dermatite seborroica, alopecia androgenetica ed ipertrofia prostatica benigna (IPB) (19). inibizione della 5α-reduttasi si manifesta in vitro sull enzima isolato, risultando in 85% di inibizione rispetto al 48% dell estratto di Serenoa repens, già ampiamente in uso sia quale integratore alimentare, sia come farmaco per l IPB. Inoltre, in vivo, l estratto di Ajuga reptans produce, a livello ematico e nel tessuto prostatico, una inibizione significativa dei livelli di diidrotestosterone in tempi prolungati rispetto alla finasteride, un farmaco con struttura steroidea utilizzato nel trattamento dell IPB. azione protettiva del teupolioside è stata valutata anche in un modello in vivo di colite sperimentale in cui l estratto di Ajuga reptans titolato in teupolioside, somministrato per via orale, ha dimostrato una notevole capacità protettiva sulla parete intestinale del colon (20). In questo studio l infiammazione del colon nel ratto è stata indotta da DNBS (acido dinitro-benzensulfonico), mentre un estratto di Ajuga reptans titolato in teupolioside è stato somministrato per via orale per 4 giorni a dosaggi di 0.2 e 2.0 mg/kg. analisi macroscopica della parete del colon ha evidenziato una notevole riduzione del danno negli animali trattati con entrambi i dosaggi dell estratto. Questo risultato è accompagnato anche da una significativa limitazione nella perdita di peso corporeo per diarrea degli animali trattati con Ajuga reptans rispetto al gruppo con solo DNBS. analisi biochimica e microscopica delle pareti del colon ha evidenziato inoltre una riduzione notevole e statisticamente significativa di tutti i principali parametri infiammatori quali infiltrazione leucocitaria, contenuto di TNF-α, IL-1β, riduzione della inos, della nitrotirosina e delle metalloproteinasi della matrice MMP2 ed MMP9. Poiché la maggior parte degli indicatori di infiammazione sono controllati dall attivazione del Nf-kB, lo studio ha anche evidenziato l azione del teupolioside su questo fattore di trascrizione. I risultati indicano che l estratto di Ajuga reptans induce una forte protezione del IkB-α, l inibitore fisiologico del Nf-kB, che agisce prevenendo la fosforilazione del NF-kB, la sua traslocazione nucleare e la conseguente attivazione di geni codificanti per proteine pro-infiammatorie. Il meccanismo specifico con cui l IkB-α viene protetto dal teupolioside non è noto ed è attualmente in fase di ricerca. Un simile meccanismo di controllo dell Nf-kB è stato descritto nel medesimo modello di colite sperimentale anche per il verbascoside da Syringa vulgaris (21) e precedentemente per altre molecole polifenoliche quali resveratrolo, epigallocatechina gallato e curcumina (22). Figura 10 Principal Component Analysis su estratti da colture di cellule (rosso) ed estratti da germogli da piante di Ajuga reptans di diversa provenienza (blu e verde) ajuga neg 13 campioni.m1 (PCA-X) t[comp.1]/t[comp.2] Pianta t[2] 0 Pianta 1b Pianta 20 Pianta 3b Pianta 11 Cell2b Cell1a Cell10 Cell3b t[1] R2X[1] = 0, R2X[2] = 0, Ellipse: Hotelling T2 (0,95) 23

8 La disponibilità di estratti standardizzati di colture cellulari di Ajuga reptans mette perciò a disposizione un ulteriore e promettente principio attivo vegetale in grado di ridurre il rischio di alterazioni infiammatorie a livello gastrointestinale. analisi metabolomica Gli estratti di colture cellulari di Ajuga reptans sono stati recentemente sottoposti ad un esteso confronto con analoghi estratti da giovani getti primaverili di Ajuga reptans mediante un sofisticato metodo analitico basato su una associazione di HPLC-ESI e Spettrometria di Massa (LC-ESI-MS) seguito da una valutazione statistica metabolomica dei componenti individuati (23). Nello studio condotto in collaborazione con il Dipartimento Scientifico e Tecnologico dell Università di Verona sono state complessivamente confrontate 472 specie molecolari, sia con campioni di estratti da cellule sia con estratti da piante di diversa provenienza. I risultati hanno evidenziato che le 472 specie molecolari sono presenti in tutti i campioni analizzati con variazione di alcune sostanze solo di livello tra gli estratti della pianta di origine e gli estratti di colture cellulari da essa derivate. La tecnica utilizzata è fra le più sensibili a disposizione ed è in grado di rilevare differenze anche fra campioni relativamente simili, quali estratti da pianta utilizzata per generare la linea cellulare, ottenuta e certificata da Il Giardino delle Erbe di Casola Valsenio (RA), ed estratti da coltura cellulare da essa derivata. Inoltre, è stata condotta un analisi cromatografica di estratti di giovani germogli di un altro gruppo di piante di Ajuga reptans raccolte nel Comune di Altavilla Vicentina (VI), mediante Met-Align di tutti i cromatogrammi ottenuti. La successiva Principal Component Analysis (PCA) che fornisce una misura delle differenze tra i gruppi di campioni analizzati è mostrata in Figura 10, dove si nota che: a l estratto da pianta da Altavilla Vicentina (in verde) non viene raggruppato con gli altri estratti da pianta ottenuti da Casola Valsenio (in blu); b la componente principale più significativa (asse delle ascisse: t(1) differenzia di meno gli estratti da cellule (in rosso) dalla pianta di origine rispetto alla pianta da altra località; c anche la separazione fra piante e cellule lungo una componente meno significativa (asse delle ordinate: t(2) differenzia meno i campioni di colture cellulari dalla pianta originale rispetto alla pianta da altra località. In conclusione, le differenze fra pianta originale e coltura cellulare da essa derivata sono significativamente inferiori rispetto alle differenze fra piante di Ajuga reptans di diversa provenienza, sottolineando con ciò la particolare naturalità dell estratto che la tecnologia delle colture cellulari consente di ottenere. Avendo esaminato i risultati del confronto fitochimico basati sull analisi metabolomica, la Commissione Unica per la Dietetica e la Nutrizione (Ministero Salute, Italia) ha riconosciuto la sostanziale equivalenza dell estratto di Ajuga reptans da colture di tessuto vegetale con l estratto tradizionale da pianta, secondo quanto previsto dalla procedura di notifica (art. 5) del Regolamento Novel food (258/97/CE). CONCLUSIONI Le biotecnologie, ed in particolare le colture di cellule vegetali, applicate alla produzione di sostanze naturali possono consentire di superare i limiti di sicurezza, disponibilità e standardizzazione insiti nel processo tradizionale di raccolta ed estrazione di piante coltivate in campo aperto. La tecnologia delle colture di cellule vegetali si propone inoltre come un processo, non OGM e pienamente ecocompatibile, che consente di disporre con continuità di sostanze, anche da piante protette, in via di estinzione o la cui benefica assunzione per ragioni diverse è caduta in disuso, senza alterazioni dei delicati equilibri naturali. I risultati ottenuti, applicando questa metodologia alla coltura cellulare di Ajuga reptans, forniscono un esempio paradigmatico della praticabilità di questo approccio dal punto di vista sia industriale, sia regolatorio, ma soprattutto costituiscono un esempio applicativo coerente con l obiettivo salutistico e funzionale alla base dell assunzione di un integratore alimentare. 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