Il Laboratorio di Analisi: Esperienze, criticità e affidabilità dei tests diagnostici

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1 Il Laboratorio di Analisi: Esperienze, criticità e affidabilità dei tests diagnostici Giorgio Bellomo, Marco Bagnati, Matteo Vidali Laboratorio Ricerche Chimico-Cliniche Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità - Novara Ruolo del Laboratorio Affidabilità ed Utilità del dato analitico Schema generale Identificazione univoca campione/paziente Controllo della fase preanalitica Analisi Conferma

2 Provvedimento del 8 settembre 28 Tale provvedimento prevede due macrofasi: I Livello di accertamenti da parte del Medico competente o di altro Operatore sanitario II Livello di approfondimento diagnostico-accertativo a carico di Strutture sanitarie competenti (SERT) Accertamenti di livello Accertamenti di SCREENING Procedure accertative da parte del Medico competente: visita medica orientata all identificazione di segni e sintomi suggestivi di assunzione prelievo del campione di urina sotto controllo introducendo misure atte ad evitare la possibilità di manomissione del campione possibilità di eseguire in sede di visita i test tossicologico-analitici con tecniche immunochimiche rapide Procedure di laboratorio presso idonee strutture autorizzate dalla regione: accertamenti analitici basati su metodi automatizzati di screening immunochimico 2

3 Accertamenti di livello Nel caso in cui risultino positivi gli accertamenti di screening: Accertamenti di CONFERMA Procedure diagnostico-accertative a carico delle Strutture Sanitarie competenti: mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa (valore medico-legale). Accertamenti di REVISIONE Possibilità di una revisione del risultato: il Lavoratore può richiedere la ripetizione dell analisi sullo stesso campione precedentemente prelevato in sua presenza o in presenza di un proprio consulente tecnico. Il campione di urina TEST ON SITE LABORATORIO ANALISI ESITO POSITIVO ESITO NEGATIVO ESITO POSITIVO ESITO NEGATIVO TEST DI CONFERMA TEST DI CONFERMA 3

4 Come va utilizzato il campione di urina Contenitore monouso da 6 ml. Si richiede una quantità di urina non inferiore a 6 ml Qualora la quantità sia insufficiente, il campione incompleto viene sigillato e riaperto solo alla presenza del soggetto per la successiva integrazione. ALIQUOTA A 2 ml Test di SCREENING ALIQUOTA B 2 ml Test di CONFERMA ALIQUOTA C 2 ml Test di REVISIONE Metodi immunochimici automatizzati Cromatografiaspettrometria di massa Cromatografiaspettrometria di massa Cosa dice la legislazione vigente? L Art. 8, comma 2dell AccordoStato/Regioni del 8 settembre 28 dice che: è necessario garantire la tracciabilità di tutte le fasi assicurando l archiviazione e le ricerche in automatico, i trasgressori incorrono nella sospensionedalla mansione o nel licenziamento. Ciò espone il lavoratore ad elevati rischi legali, tale prassi ha lo scopo di ridurre la documentazione cartacea da compilare, occorre tutelare tutti i soggetti coinvolti: Lavoratore, Azienda, Medico competente, Laboratorio per gli esami di primo livello, Laboratorio per gli esami di conferma. 4

5 DROGHE D ABUSO E METABOLITI DROGHE NATURALI: Tetraidrocannabinolo (Cannabis Indica) Ac.(L)-NOR-D-9-THC-9-COOH Morfina, Codeina (Papaver Somniferum) Cocaina (Erythroxylon Coca) Benzoilecgonina DROGHE SINTETICHE: Eroina 6-monoacetilmorfina Morfina Metadone EDDP Buprenorfina Norbuprenorfina Amfetamina Metamfetamina MDA (Love pill o Speed for lovers) MDE (Eva) MDMA (Ecstasy) MATRICI Urina Concentrazioni alte, non invasiva, semplice da trattare, facile da conservare Saliva Prelievo ed analisi in strada Le concentrazioni salivari correlano con quelle ematiche, bassa concentrazione, I campioni di saliva devono essere analizzati rapidamente in quanto batteri eventualmente presenti ed enzimi potrebbero decomporre le sostanze contenute. Il principio attivo della cannabis (D9-tetraidrocannabinolo, D9-THC o THC) diffonde difficilmente dal sangue alla saliva a causa della sua scarsa idrosolubilità Sudore Prelievo ed analisi in strada PLASMA/SIERO/SANGUE La concentrazione plasmatica è direttamente correlabile allo status psicofisico del soggetto al momento del prelievo, invasivo, concentrazioni basse Matrice cheratinica (capelli/peli) Concentrazioni basse, consumo cronico, trattamento necessario 5

6 SCREENING Analisi di Screening: Analisi preliminare che fornisce un risultato presuntivo, ovvero la probabile negatività o positività di un campione rispetto ad una sostanza/classe di sostanze e in riferimento a un valore di cut-off prestabilito. Per definizione, un risultato positivo ottenuto con un'analisi di screening non può assumere valenza forense [GTFI 3 rev 2] Risultato: qualitativo o semiquantitativo Risultato semiquantitativo: non possiede caratteristiche di precisione ed accuratezza in quanto proviene da curve di tarature di tipo sigmoide, risente di interferenti e cross reattività (non tutti gli analiti rispondono nello stesso modo) CUT-OFF Cut-off: Limite di concentrazione definito, in maniera convenzionale e arbitraria, per stabilire la negatività ovvero la positività nel caso di analisi di screening di un campione. 6

7 SENSIBILITÀ vs SPECIFICITÀ Sensibilità = Veri Positivi Veri Positivi + Falsi Negativi capacità di identificare correttamente gli assuntori Specificità = Veri Negativi Veri Negativi + Falsi Positivi capacità di identificare correttamente i non assuntori SCREENING Veri Negativi Veri Positivi Frequenza FP FN Concentrazione Massima sensibilità FN = Cut-Off Massima specificità FP = 7

8 CUT-OFF PER L ANALISI DI SCREENING Classe Urina (ng/ml) Saliva (ng/ml) Capelli (ng/mg) Oppiacei 3 4,2 Cocaina e metaboliti 3 2,5 Cannabinoidi e metaboliti Amfetamine Metamfetamine MDMA e analoghi 5 4, 5 a / b 5,2 Metadone e metaboliti 3.2 Buprenorfina e metaboliti 5 a - Accordo Stato-Regioni per le mansioni a rischio b - Art. 87 C.d.S. APPROCCIO METODOLOGICO SCREENING - + STOP CONFERMA Aspetto diagnostico Classe Esecuzione: 3 min - h Nessuna preparazione Immunocromatografici Metodi immunometrici (CEDIA, EMIT, FPIA, Biochip, KIMS) Aspetto legale Sostanza Esecuzione: -2 giorni Preparazione manuale Metodi cromatografici (GC-MS, LC-MS) 8

9 AUTENTICITÀ DEL CAMPIONE CREATININURIA valori di riferimento 25-3 mg/dl concentrazioni fra 2 e 4 mg/dl sono fortemente sospette di adulterazione (diluizione), in vivo o in vitro cut-off 2 mg/dl; per valori inferiori il campione è da considerare inattendibile in quanto adulterato (diluito). PESO SPECIFICO valori di riferimento.3.3 cut-off.3; per valori inferiori il campione è da considerare inattendibile in quanto adulterato. ph valori di riferimento cut-off: 3-; per valori inferiori a 3 e superiori a il campione è da considerare inattendibile in quanto sicuramente adulterato. ADULTERAZIONE DEL CAMPIONE NITRITI Sostanze riducenti che interferiscono nelle reazioni NAD-NADH e nel riconoscimento dell anticorpo specifico per la sostanza originale. Possono esser presenti nelle urine, in conseguenza di crescita batterica (per infezione delle vie urinarie o per contaminazione esterna) ma a concentrazioni tali da non interferire con i test diagnostici. Possono essere indice di adulterazione in vitro per aggiunta di sostanze attualmente in commercio. cut-off 5 mg/dl. Valori massimi riscontrati in condizioni naturali sono di,3 mg/dl. GLUTARALDEIDE Sostanza polimerizzante che interferisce nel legame antigeneanticorpo. Non è presente come componente normale nelle urine per cui il suo riscontro è indice di adulterazione. Cut-off zero (assente) OSSIDANTI E CANDEGGINA Analizzando il valore di ossidanti/clorocromato di piridinio (PCC) si ricerca la presenza di agenti ossidanti quali candeggina e acqua ossigenata. Il clorocromato di piridinio (venduto con il marchio commerciale UrineLuck) è una sostanza adulterante comunemente usata. Normalmente l urina non dovrebbe contenere ossidanti o PCC. 9

10 METODO IMMUNOCROMATOGRAFICO Test speditivo on site (qualitativo) Droga immobilizzata Droga campione Ab-pigmento SCREENING DROGHE TEST SPEDITIVO

11 SCREENING: RISULTATI TEST SPEDITIVO SCREENING: SEMIQUANTITATIVA - I

12 SCHEMA DELLA REAZIONE FPIA SREENING: SEMIQUANTITATIVA - II 2

13 SCHEMA DELLA REAZIONE EMIT Screening: semiquantitativa - III Drugs of Abuse Array PLUS (DoA PLUS) Amfetamine Metamfetamine Barbiturici Benzodiazepine Benzodiazepine 2 Cannabinoidi Cocaina (Benzoilecgonina) Metadone Oppiacei Fenciclidina Buprenorfina MDMA Creatinina 3

14 SCHEMA DELLA REAZIONE CON BIOCHIP Generazione di luce che viene quantificata per determinare la quantità di analita presente nel campione. Anticorpo secondario E E DTR Y Y Cattura analita Superficie Biochip con DTR Anticorpi legati covalentemente alla superficie del biochip ESEMPI DI FALSI POSITIVI Amfetamine e simili Selegilina, Vicks Inhaler Barbiturici Benzodiazepine Cannabinoidi Oppiacei FANS (ibuprofene, naproxen) Oxaprozin FANS (ibuprofene, naproxen) Fluoroquinolone (Ofloxacina, Levofloxacina) Rifampin Fenciclidina Venlafaxine Dextrometorfano 4

15 ANALISI DI CONFERMA o II LIVELLO CUT-OFF PER ANALISI DI CONFERMA Classe Urina (ng/ml) Urina conferma (ng/ml) Plasma conferma (ng/ml) Oppiacei 3 Cocaina e metaboliti 3 Cannabinoidi e metaboliti Amfetamine Metamfetamine MDMA e analoghi a / b 25 2 Metadone e metaboliti 3 Buprenorfina e metaboliti a - Accordo Stato-Regioni per le mansioni a rischio b - Art. 87 C.d.S

16 Preparazione del campione ANALISI DI CONFERMA 6

17 CROMATOGRAMMA DELLA MISCELA TEST RICONOSCIMENTO ANALITA (cocaina) 7

18 HPLC/MS MS Fasi mobili Comparto portacolonna Sorgente ESI Q Q2 Q3 Computer Autocampionatore Pompa binaria CROMATOGRAMMA- Cocaina Metadone Morfina 6-MAM Codeina Benzoilecgonina EDDP Morfina Metadone 8

19 EVIDENCE: SCREENING VS CONFERMA RANDOX 88 POS 3 (,6%) NEG 85 (98,4%) numero campioni cannabinoidi cocaina oppiacei amfetamine codeina>morfina codeina I test di conferma sono stati ottenuti mediante tecnica LC/MS/MS con strumentazione Agilent 29Infinity/TripleQuad64 neg pos 3 AXSYM-AG: SCREENING VS CONFERMA Axsym 7 POS 56 (32,7%) NEG 5 (67,3%) 35 numero campioni codeina>morfina codeina neg 29 pos 8 6 cannabinoidi cocaina oppiacei amfetamine 9

20 AXSYM: SCREENING Axsym 474 POS 7 (5,%) NEG 43 (85,%) cocaina 22 oppiacei 7 amfetamine 5 cannabinoidi 37 ESTERNI: SCREENING VS CONFERMA numero campioni codeina>morfina codeina neg pos cannabinoidi cocaina oppiacei amfetamine 2

21 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Urina PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Plasma 2

22 Screening (urina) vs Conferma (plasma) Oppiacei Paziente Oppiacei [Morfina] 2 L [Codeina] 2 L [6-MAM] 2 L > > > 4 > > 2 9 In verde sono evidenziati i valori inferiori al Cut-Off Screening (urina) vs Conferma (plasma) Cocaina Paziente Cocaina [Cocaina] 2 L > > > >5 7 >5 6 8 > > > >5 54 In verde sono evidenziati i valori inferiori al Cut-Off [BEG] 2 L

23 Screening (urina) vs Conferma (plasma) Cannabinoidi Paziente Cannabinoidi [THC] 2 L [THC-COOH] 2 L In verde sono evidenziati i valori inferiori al Cut-Off Screening (urina) vs Conferma (plasma) Amfetamine Paziente Amfetamine [Amfetamine] [Metamfetamine] [MDA] [MDMA] [MDE] 2 L 2 L 2 L 2 L 2 L > In verde sono evidenziati i valori inferiori al Cut-Off 23

24 CONFERME: URINE vs SANGUE livello urina (ng/ml) 2 livello urina (ng/ml) 2 livello plasma (ng/ml) Pz cannabinoidi 46 THC-COOH 5 5 THC THC-COOH Pz 2 >5 cocaina COCAINA BEG COCAINA BEG Pz 3 >5 cocaina COCAINA BEG 749 COCAINA BEG Pz 4 >5 cocaina 465 BEG 62 BEG Pz 5 > oppiacei cannabinoidi CODEINA MORFINA THC-COOH 2 CODEINA THC THC-COOH Pz 6 cannabinoidi 979 THC-COOH 64 THC THC-COOH Pz 7 >5 cocaina COCAINA BEG 68 9 COCAINA BEG Pz 8 > oppiacei MORFINA CODEINA 6-MAM MORFINA CODEINA 6-MAM Pz 9 >8 amfetamine MDA MDMA 3 7 MDA MDMA Pz cannabinoidi 32 THC-COOH 2 2 THC THC-COOH Etanolo (primo livello): chimicaclinica Reazione: Rivelazione: Tempi di disponibilità del risultato: Enzimatica (Alcol Deidrogenasi) Spettrofotometrica UV (NADH a 34nm) 8 min CVa: 3.2 % 24

25 Attività annuale Attivià annuale (2): 24 Valenza sanitaria: 77 Valenza giudiziaria: 43 Positivi per Valenza sanitaria: % Positivi per Valenza giudiziaria: 5.8 % Spettri di massa alcoli (.683) Cm (:-57:63) alcoli 6 (.793) Cm (5:7-46:74) 3.29e5 3.45e5 32 CH 3 OH CH 3 CH 2 OH % % m/z m/z alcoli 22 (.94) Cm(2:23-47:64) 45.66e5 CH 3 CH 3 CH OH % m/z alcoli 28 (2.3) Cm(28:3-49:6) e5 CH 3 4 CH % 3 3 C OH CH m/z alcoli 38 (2.97) Cm(37:39-5:62) 3 % m/z alcoli 99 (3.35) Cm(98:-49:87) 7.68e4 3.82e CH 3 CH 2 CH 2 OH 43 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 OH % m/z 25

26 Miscela di alcoli ed isomeri t-butanolo 2. Scan EI+ TIC.69e6 % Metanolo.68 ETANOLO Isopropanolo.9.79 n-propanolo n-butanolo Time Correlazioni primo livello/conferma Etanolo, mg/dl (conferma) Etanolo, mg/dl (I livello) 26

27 Transferrina carboidrato-carente Transferrina carboidrato-carente Helena Stibler et al, Abnormal microheterogeneity of transferrin in serum and cerebrospinal fluid in alcoholism, Acta Med. Scand, 978; 24:49-56 Studio condotto sul liquido cerebrospinale di pazienti affetti da degenerazione cerebellare alcolica. Identificazione mediante isoelectrofocusing di isoforme particolari della transferrina caratterizzate da un punto isoelettrico piu elevato (pi >5.7) rispetto a quello dell isoforma maggiore. 27

28 Transferrina carboidrato-carente H. Stibler, S. Borg. Glycoprotein glycosyltransferase activities in serum in alcohol-abusing patients and healthy controls. Scand J Clin Lab Invest. 5(99)43-5. Ridotta attività degli enzimi galattosiltransferasi e Nacetylglucosaminyltransferasi Xin Y, Lasker JM, Lieber CS. Serum carbohydrate-deficient transferrin: mechanism of increase after chronic alcohol intake. Hepatology. 22(995) Ridotta attività degli enzimi sialil, galattosil e Nacetilglucosaminiltransferasi e aumentata attività della sialidasi. Transferrina carboidrato-carente Area DST DST % = Area totale transferrina 28

29 Transferrina carboidrato-carente Transferrina carboidrato-carente Variante C 2 C 3 29

30 Transferrina carboidrato-carente Variante BC CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE Il come non può essere disgiunto dal che cosa La massima qualità ed affidabilità di un dato di Laboratorio deriva da un connubio felice ed intelligente fra procedure ed analisi E indispensabile, in ogni fase, conoscere con certezza la propria incertezza 3