I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H

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1 Istruzioni per l Uso TGF-beta 1 ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di TGF-beta 1 umano nei supernatanti delle colture cellulari, siero e plasma umani. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, GermanyFax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 4 4. REAGENTI FORNITI 5 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 5 6. RACCOLTA DEI CAMPIONI ED ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE 6 7. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI 6 8. PRECAUZIONI PER L USO 6 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROTOCOLLO DI TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST (23) 1/18

3 1. USO PREVISTO Il TGF-beta 1 umano ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo del TGF-beta1 umano. L ELISA TGF-beta 1ELISA è esclusivamente a uso della ricerca. Non si usa per procedure terapeutiche. 2. SOMMARIO La trasformazione del fattore di crescita beta (TGF beta) è una apleiotropicitocina che presenta un ampio spettro di effetti biologici e regolatori a livello cellulare e organismo. Esso svolge un ruolo fondamentale nella sintesi e degradazione della matrice extracellulare (ECM), nel controllo delle interazioni mesenchimaliepiteliali durante l'embriogenesi, la modulazione immunitaria, l'apoptosi, la progressione del ciclo cellulare, l'angiogenesi, l'adesione e la migrazione e la chemiotassi leucocitaria. Esso ha sia attività di soppressione tumorale che di tumore ed è altamente regolamentato a tutti i livelli (ad esempio: turnover di mrna, attivazione latente di proteine o modificazioni post-traslazionali). TGF beta è la prima proteina riconosciuta di almeno 40 di TFF beta-famiglia di strutture strutturalmente correlate citochine. Tre isoforme (TGF beta 1-3) sono state descritte nei mammiferi. (Ogni isoforma è codificata da un gene unico su diversi cromosomi, tutti legati agli stessi recettori). Sono sintetizzati dalla maggior parte dei tipi di cellule e dei tessuti. Le cellule del sistema immunitario esprimono principalmente TGF beta1. La beta inattiva inizialmente sequestrata (latente TGF beta) richiede l'attivazione (scissione e dissociazione della sua regione peptidica associata alla latenza) prima che possa esercitare un'attività biologica. LTGF beta può anche essere legata a LTB (latente TGF beta legante proteina) per formare un grande complesso latente (LLC). TGF beta forma omodimeri e le sue sottounità di 12,5 kda sono legate da ponti di disolfuro. La trasduzione di beta-tgf è mediata attraverso i recettori beta-tgf tipo II e I, la fosforilazione e i cambiamenti conformazionali seguiti da percorsi diversi: SMAD (- percorso: il reclutamento beta di TGF porta infine alla fosforilazione di SMADs recettori-regolati (R-SMADs = SMAD 2, 3) e il legame di SMAD comune (cosmad = SMAD 4). Il complesso R-SMAD / cosmad entra nel nucleo e interagisce con un certo numero di fattori di trascrizione, coactivators e corepressors. TGF beta induce la trasduzione del segnale dipendente dalla chinasi MAPK e MAP / ERK (JNK / MAPK-, JNK / SPAK-, p38-, ERK1 / 2) e il percorso NF-κB. TGF betamediates l'arresto della crescita del ciclo cellulare attraverso il patho fosinositide 3-chinasi / Akt. TGF betasignaling è altamente regolato, ad esempio. (SMADs = SMAD 6, 7) o legame delle ligasi E3-ubiquitina Smurf1 e Smurf2 o / e co-receptors. TGF beta 1 è il mediatore chiave nella fisiopatologia della riparazione del tessuto e della fibrogenesi umana: equilibrio tra produzione e degradazione del collagene di tipo I, fibrosi e cicatrici in organi e tessuti. TGF beta 1 presenta importanti caratteristiche immunoregolatrici di carattere parzialmente avverso: TGF beta 1 inibisce la proliferazione, la differenziazione e la produzione di anticorpi B e T, nonché la maturazione e l'attivazione dei macrofagi. Inibisce l'attività delle cellule NK e delle cellule killer attivate con linfocina e blocca la produzione di citochine. TGF beta 1 promuove la differenziazione delle cellule Treg, con conseguente produzione di IL-10 / TGF beta 1 e soppressione delle cellule Th1 e Th2. E stato recentemente dimostrato che TGF beta 1 promuove lo sviluppo di Th17 in presenza di IL-6 o IL-21 nei topi e probabilmente svolge un ruolo nello sviluppo umano Th17 insieme a IL-1 beta, IL-21 e IL-23. In questo contesto TGF beta 1 è coinvolto nell'induzione e nella mediazione di risposte pro infiammatorie e allergiche (23) 2/18

4 Cancro: TGF beta 1 è sovraespresso in un'elevata percentuale di tumori umani (ad esempio: cancro al seno, prostata, cellule renali, pancreatico, ovarico, cervicale e gastrico, melanoma, linfoma non-hodgkin, mieloma multiplo) ed è stato correlato con scarse prognosi. TGF beta 1 funge da soppressore tumorale (in particolare nella fase iniziale della cancerogenesi) e come promotore tumorale (vale a dire, progressione tumorale, invasione e metastasi). Le cellule maligne secernono TGF beta 1, sopprimendo le risposte immunitarie antitumorali e creando una tolleranza immune. Le mutazioni nel sentiero di segnalazione beta 1 di TGF (ad esempio la perdita di recettori delle superfici cellulari, la diminuzione dell'espressione SMAD) rendono i tumori refrattari agli effetti inibitori della crescita e all'apoptosi di TGF beta 1. Malattie autoimmuni: TGF beta 1 è funzionalmente connessa ad anomalie del sistema immunitario più importanti come il lupus sistemico eritematoso (SLE). Nella sclerosi multipla (MS) la sovraregolazione di TGF beta 1 sembra correlare con un corso benigno e una disabilità minore di MS. In epatite autoimmune (AIH) il siero TGF beta 1 è stato regolato. Il rimodellamento patologico del tessuto connettivo nella sclerosi sistemica (SSc) è attribuito all'attivazione del percorso TGF beta 1 / SMAD. Nei topi, il trasferimento del gene TGF beta 1 al colon conduce alla fibrosi intestinale e serve come modello per la malattia di Crohn (CD). Fegato: L'espressione di TGF beta 1 aumentata è stata evidenziata nella fibrosi epatica delle malattie epatiche croniche (epatite cronica, cirrosi alcolica). Il virus dell'epatite C aggiorna la trascrizione del TGF beta 1 nel fegato e eleva i livelli di TGF beta 1 circolanti. La disgregazione delle vie di sintesi TGF beta 1 e / o di segnalazione impedisce la formazione di cicatrici nella fibrosi epatica. La rimozione del collagene in eccesso dopo la cessazione della malattia epatica è regolata da TGF beta 1. Malattie renali: La glomerulonefrite e la nefropatia diabetica dovuta all'accesso eccessivo di ECM all'interno del mesangium dei glomeruli sono attribuiti ad elevati livelli di TGF beta 1. I livelli di TGF beta 1 urinari dei pazienti con queste malattie sono elevati. Diabete: i livelli di espressione e le attività di chinasi di componenti del percorso di segnalazione beta di TGF sono alterati nelle malattie del pancreas. I bassi livelli beta di TGF in pazienti con diabete di tipo I possono contribuire alla mancanza di immunosoppressione, alla propagazione e al mantenimento della malattia. Malattie cardiovascolari: TGF beta 1 è anti-aterogenico e ateroprotettivo, ma perde il suo ruolo protettivo e presenta effetti patogeni nella malattia cronica. I livelli di beta-tgf aumentati sono stati riscontrati nei campioni clinici aterosclerotici. Cardiomiopatie dilatate, ischemiche e ipertrofiche sono associate ad alti livelli di beta-tgf. TGF beta 1 induce le cellule endoteliali a subire EndMT (transizione endotelialemesenchimale), che contribuisce alla progressione della fibrosi cardiaca associata a malattie cardiache croniche. I livelli di siero di TGF beta 1 diminuiti in sepsi e pazienti con ictus acuto possono riflettere il cambiamento dello stato immunologico-infiammatorio di questi pazienti. Il rimodellamento dopo l'infarto miocardico è attribuito a TGF beta 1. È stata descritta una upregulation di TGF beta 1 nel sistema nervoso centrale dopo il danno cerebrale indotto da ischemia. È stato trovato un ruolo neuro protettivo di TGF beta 1 contro la morte cellulare neuronale indotta da ischemia. Asma, disturbo polmonare ostruttivo cronico (COPD), fibrosi cistica (CF): TGF beta 1 svolge un ruolo importante nelle malattie croniche delle vie aeree, in particolare nel rimodellamento delle vie aeree. Sono stati descritti livelli di beta-tgf aumentati in pazienti con infiammazione eosinofila eccessiva di asma e di vie aeree e sono stati correlati al grado di fibrosi sub epiteliale. Nei modelli di topo il diminuito livello di TGF beta 1 aiuta a ridurre la fibrosi peribronchiale, la proliferazione muscolare liscia delle vie aeree e la produzione di muco. TGF beta 1 è stato dimostrato di indurre l'apoptosi nelle cellule epiteliali delle vie aeree. L'attivazione locale di TGF beta mediata da Integrin è fondamentale per lo sviluppo di edema polmonare in lesioni polmonari acute. Altri: in pazienti con Alzheimers (AD) è correlata alla deposizione di beta-amiloide nei vasi sanguigni cerebrali danneggiati. Un certo numero di chemochine proinfiammatorie tra cui TGF beta 1 sono costantemente elevate nei cervelli di pazienti autistici. I livelli di siero TGF beta 1 sono diminuiti per i pazienti con malaria acuta. Nella parodontite aumentatii livelli di TGF beta 1 sono stati misurati in fluido crevicolare gengivale. I pazienti con distrofia muscolare duchenne hanno mostrato livelli elevati di TGF beta 1 e fibrosi. Sono stati mostrati eventi di segnalazione beta di TGF in fibroblasti sclerodermici. TGF beta 1 è un potente stimolatore della produzione di matrice di condrociti rispetto alla fibrosi tissutale e potrebbe quindi svolgere un ruolo importante nel metabolismo osseo (osteoartrosi) (23) 3/18

5 3. PRINCIPIO DEL TEST I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento TGF-beta1 anti-umano. Figura 1 Micropozzetto Rivestito Figura 2 Anticorpo di Rivestimento Il TGF-beta1 umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Prima Incubazione Standard o Campione Vi si aggiunge un anticorpo anti-umano TGF-beta1 coniugato alla biotina, che si lega con il TGF-beta1 umano catturato dal primo anticorpo. Figura 3 Seconda Incubazione Dopo l incubazione l anticorpo TGF-beta1 coniugato alla biotina non legato viene rimosso durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo TGFbeta1 coniugato alla biotina. Figura 4 Standard o Campione Coniugato di Biotina Terza Incubazione Streptavidina-HRP (23) 4/18

6 Figura 5 Dopo l incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione dei substrato reattiva all HRP Quarta Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di TGF-beta1 umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di TGF-beta1 umano e si determina la concentrazione del campione di TGF-beta1 umano. Figura 6 Substrato post-reazione 4. REAGENTI FORNITI 1 busta d alluminio con una Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale TGF-beta1 umano 1 flaconcino (120 μl) di Coniugato di Biotina anticorpo policlonale TGF-beta1 anti-umano 1 flaconcino (150 μl) di Streptavidina-HRP 2 flaconcini di Standard di TGF-beta1 umano liofilizzato, 4 ng/ml se ricostituito 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con l 1 % di Tween 20 e 10 % di BSA) 1 bottiglia (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con l 1 % di Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Substrato (Tetrametilbenzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido Fosforico 1M) 6 Film adesivi 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE KIT ELISA Conservare i reagenti del kit ad una temperatura tra 2 C ed 8 C. I reagenti rimanenti, immediatamente dopo l uso, devono essere riposti e conservati al freddo (tra 2 C ed 8 C). La data di scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La scadenza delle componenti del kit può essere garantita solo se le componenti sono conservate in modo corretto e se, in caso di uso ripetuto di un componente, questo reagente non è stato contaminato nel corso delle manipolazioni precedenti (23) 5/18

7 6. RACCOLTA DEI CAMPIONI ED ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE Con questo dosaggio sono stati testati il supernatante delle colture cellulari*, il siero ed il plasma (EDTA ed eparina). Altri materiali biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione, rimuovere il siero dal coagulo non appena possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di TGF-beta1 umano bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. * In campioni di supernatante delle colture cellulari contenenti componenti del siero (ad es. FCS), prestare attenzione ad un segnale del bianco eventualmente elevato, a causa dei livelli latenti di TGF-beta1 nel siero animale. 7. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI - 1N NaOH e 1N HCL - Pipette graduate da 5 ml e 10 ml - Micropipette adattabili da 5 μl a 1000 μl a canale singolo, con punte usa e getta - Micropipette adattabili da 50 μl a 300 μl, multicanale con punte usa e getta - Serbatoio per micropipette multicanale - Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti - Dispositivo per dispensare la soluzione di lavaggio (bottiglia di lavaggio multicanale o sistema di lavaggio automatico) - Agitatore per micropiastre - Lettore di strip per micropozzetti in grado di leggere a 450 nm (620 nm come lunghezza d onda riferimento opzionale) - Acqua distillala in vetro o deionizzata - Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione 8. PRECAUZIONI PER L USO - Tutte le sostanze chimiche sono da considerarsi potenzialmente pericolose. Raccomandiamo quindi che il prodotto venga maneggiato esclusivamente da personale debitamente istruito alle tecniche di laboratorio e che venga usato secondo i principi della buona pratica di laboratorio. Indossare indumenti di protezione idonei, come camici da laboratorio, occhiali e guanti di protezione. Evitare il contatto con la pelle o gli occhi. In caso di contatto con pelle o occhi lavare immediatamente con acqua. Consultare lascheda di sicurezza o dichiarazioni di sicurezza del prodotto per indicazioni più specifiche. - L uso dei reagenti è inteso solo l'uso di ricerca e non dev essere usato per procedure terapeutiche. - Non mescolare o sostituire i reagenti con quelli di altri lotti o di diversa provenienza. - Non usare i reagenti dei kit oltre la data di scadenza indicata sull etichetta. - Durante il magazzinaggio o l incubazione non esporre i reagenti del kit a luce intensa. - Non pipettare con la bocca. - Non mangiare o fumare nelle aree di manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni (23) 6/18

8 - Evitare il contatto della pelle o delle membrane mucose con i reagenti dei kit o i campioni. - Durante la manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni indossare guanti di gomma o di lattice usa e getta. - Evitare il contatto della soluzione di substrato con agenti ossidanti e metalli. - Evitare schizzi o generazione di vapori (aerosol). - Usare punte di pipette e/o pipette usa e getta per evitare la contaminazione microbica o la contaminazione crociata dei reagenti o dei campioni, che potrebbero invalidare il test. - Usare vassoi puliti e dedicati per distribuire il coniugato ed il reagente del substrato. - L esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Per la preparazione del reagente deve essere usata acqua distillata in vetro o deionizzata. - Prima dell uso la soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente. - Decontaminare e eliminare i campioni e tutti i materiali potenzialmente contaminati in quanto potrebbero contenere agenti infettivi. Il metodo preferenziale per la decontaminazione è l autoclavaggio per minimo un ora a C. - I rifiuti liquidi che non contengono acidi e i rifiuti neutralizzati possono essere mescolati con ipoclorito di sodio in volumi tali che la miscela finale contenga l 1.0 % di ipoclorito di sodio. Per una reale decontaminazione sono necessari 30 minuti. I rifiuti liquidi contenenti acidi devono essere neutralizzati prima dell aggiunta d ipoclorito di sodio. 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Gli Concentrati dei Tamponi di Reagenti devono essere portati a temperatura ambiente e diluiti prima di iniziare la procedura del test. Se si formano cristalli nei Concentrati dei Tamponi, riscaldarli gradualmente al punto che si dissolvano completamente Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare tutto il contenuto (50 ml) della Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare al volume complessivo di 1000 ml con acqua distillata in vetro o acqua deionizzata. Mescolare con cautela per evitare lo schiumaggio. Trasferire in una bottiglia di lavaggio pulita e conservare a temperatura tra 2 C e 25 C. Tenere in considerazione che il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Lavaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare tutto il contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro pulito e graduato da 100 ml. Portare al volume complessivo di 100 ml con acqua distillata. Mescolare con cautela per evitare lo schiumaggio. Conservare a una temperatura tra 2 C e 8 C. Tenere in considerazione che la Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Dosaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) (23) 7/18

9 9.3. Preparazione di Coniugato di Biotina Tenere in considerazione che il Coniugato di Biotina deve essere usato entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Coniugato di Biotina con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Streptavidina-HRP Tenere in considerazione che la Streptavidina-HRP deve essere usata entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Streptavidina-HRP con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Stisce Streptavidina-HRP (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard TGF-beta1 Umana Ricostituire lo standard TGF-beta1 umana aggiungendo con acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 4 ng/ml). Lasciare lo standard a ricostituire per minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. Le diluizioni standard si possono preparare direttamente sulla piastra per micropozzetti (vedi 10.d) o, in alternativa, in tubi (vedi 9.5.1) Diluizione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Quindi preparare diluizioni seriali 1:2 per la curva standard come segue: Pipettare 225 μl di Tampone di Dosaggio (1x) in ogni tubo. Pipettare 225 μl di standard ricostituito (concentrazione = 4 ng/ml) nel primo tubo, etichettato come S1, e mescolare (concentrazione dello Standard 1 = 2 ng/ml). Pipettare 225 μl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mescolare accuratamente prima del trasferimento seguente. Ripetere le diluizioni seriali altre 5 volte creando così i punti della curva standard (vedi Figura 7). Il Tampone di Dosaggio (1x) serve come bianco (23) 8/18

10 Figura 7 Transferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 TGF-β1 Umana Standard Ricostituito Tampone di Dosaggio (1x) 225 µl Scartare 225 µl 10. PROTOCOLLO DI TEST a. Preparare i campioni prima di iniziare la procedura di test. Diluire i campioni di siero, plasma e degli supernatanti di cultura cellulari 1:10 con Tampone di Dosaggio (1x) secondo il seguente schema: 20 μl di campione μl Tampone di Dosaggio (1x) Aggiungere 20 μl di 1N HCI a 200 μl di campione prediluito, miscelare e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Neutralizzare con aggiunta di 20 μl 1N NaOH. b. Determinare il numero di strip micropozzetti necessario a testare il numero desiderato di campioni, oltre al numero idoneo di pozzetti necessari per eseguire i bianchi e gli standard. Ogni campione, standard, bianco e campione di controllo opzionale dev essere dosato in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non usate e conservarle insieme all essiccante fornito nella bustina metallica, chiusa ermeticamente a una temperatura di 2-8 C. c. Lavare le strip micropozzetti due volte con un Tampone di Lavaggio di circa 400 μl per ogni pozzetto; aspirare completamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l altro. Prima di aspirare, lasciare il Tampone di Lavaggio all interno dei pozzetti per circa secondi prima dell aspirazione. Fare attenzione a non scalfire la superficie dei pozzetti. Dopo l ultima fase di lavaggio, svuotare i pozzetti e picchiettare le strip micropozzetti su carta assorbente o su una salvietta di carta per rimuovere il Tampone di Lavaggio in eccesso. Usare le strip micropozzetti immediatamente dopo il lavaggio. In alternativa, le strip micropozzetti possono essere collocate capovolte su una carta assorbente bagnata per non oltre15 minuti. Non lasciar asciugare i pozzetti. d. Diluizione standard sulla piastra per micropozzetti (In alternativa, la diluzione standard si può preparare in tubi - vedi 9.5.1): Aggiungere100 μl Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti degli standard. Pipettare 100 μl di standard preparato (vedi Preparazione dello Standard 9.5, concentrazione = 4000 pg/ml), in duplicato, nei pozzetti A1 ed A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 aspirando ed espellendo ripetutamente (concentrazione dello standard 1 S1 = 2000 pg/ml) e trasferire 100 μl rispettivamente nei pozzetti B1 e B2 (vedi Figura 8). Fare attenzione a non scalfire la superficie interna dei pozzetti. Ripetere la procedura 5 volte creando due serie di diluizioni standard di TGF-beta1 umano con un range da 2000 a 31 pg/ml. Scartare 100 μl del contenuto degli ultimi micropozzetti (G1, G2) usati (23) 9/18

11 Figura 8 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 TGF-β1 Umano Standard Ricostituito Tampone di Dosaggio (1x) 100 µl Scartare 100 µl Nel caso di una diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1), pipettare 100 μl di queste diluizioni dello standard (S1 to S7) nei pozzetti dello standard, come da Tavola 1. Tavola 1 La tavola descrive un esempio dell organizzazione dei bianchi, degli standard e dei campioni nelle strisce dei micropozzetti A Standard 1 (2000 pg/ml) Standard 1 (2000 pg/ml) Campione 1 Campione 1 B Standard 2 (1000 pg/ml) Standard 2 (1000 pg/ml) Campione 2 Campione 2 C Standard 3 (500 pg/ml) Standard 3 (500 pg/ml) Campione 3 Campione 3 D Standard 4 (250 pg/ml) Standard 4 (250 pg/ml) Campione 4 Campione 4 E Standard 5 (125 pg/ml) Standard 5 (125 pg/ml) Campione 5 Campione 5 F Standard 6 (63 pg/ml) Standard 6 (63 pg/ml) Campione 6 Campione 6 G Standard 7 (31 pg/ml) Standard 7 (31 pg/ml) Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8 e. Aggiungere 100 μl di Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) in duplicato ai pozzetti del bianco. f. Aggiungere 60 μl di Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) ai pozzetti del campione. g. Aggiungere 40 μl di ogni campione pretrattato in duplicato ai pozzetti del campione. h. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) i. Preparare il Conjugato di Biotina (vedi 9.3 Preparazione del Coniugato di Biotina). j. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 5 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente (23) 10/18

12 k. Aggiungere 100 μl Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. l. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) m. Preparare la Streptavidina-HRP (fare riferimento alla preparazione della Streptavidina-HRP 9.4). n. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 5 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. o. Aggiungere 100 μl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco. p. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) q. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 5 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. r. Pipettare 100 μl di Soluzione di SubstratoTMB in tutti i pozzetti. s. Incubare le strip dei micropozzetti a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 30 minuti. Evitare l esposizione diretta a luce intensa. Lo sviluppo cromatico sulla piastra dev essere monitorato e la reazione del substrato dev essere bloccata (vedi prossimo punto di questo protocollo) prima che i valori dei pozzetti positivi non siano più correttamente registrabili. Il periodo ideale di tempo necessario per lo sviluppo del colore dev essere determinato individualmente per ogni dosaggio. Si raccomanda di aggiungere la soluzione bloccante quando lo standard più alto ha raggiunto un colore blu scuro. In alternativa, lo sviluppo del colore può essere monitorato con il lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato dev essere bloccata non appena lo Standard 1 ha raggiunto un DO di t. Bloccare la reazione dell enzima pipettando velocemente 100 μl di Soluzione Bloccante in ogni pozzetto. E importante che la Soluzione Bloccante venga distribuita velocemente ed uniformemente su tutti i pozzetti per inattivare completamente l enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l aggiunta della Soluzione Bloccante, o entro 1 ora se le strip dei micropozzetti sono conservate al buio e ad una temperatura di 2-8 C. u. Leggere l assorbanza di ogni micropozzetto con uno spettrofotometro usando 450 nm. come lunghezza d onda primaria (in alternativa, 620 nm. come lunghezza d onda di riferimento; da 610 nm a 650 nm. il valore è accettabile). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e usando i pozzetti del bianco. Determinare l assorbanza sia dei campioni, sia degli standard (23) 11/18

13 11. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di TGF-beta1 umano sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di TGF-beta1 umano circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di TGF-beta1 umano. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione di 1:30 (20 μl di campione μl Tampone di Dosaggio (1x) + 20 µl 1 N HCl + 20 µl 1 N NaOH e 40 µl campione pretrattato + 60 µl Tampone di Dosaggio (1x)), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 30). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di TGF-beta1 umano. Questi campioni richiedono un ulteriore prediluizione esterna secondo i valori stimati dell TGF-beta1 umano, con un Tampone per Dosaggio (1x) in modo da quantificare con precisione i livelli reali di TGF-beta1 umano. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di TGF-beta1 umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 9 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 9 Curva standard rappresentativa per il TGF-beta1 umano ELISA. Lo TGF-beta1 umano è stato diluito in 2 fasi seriali nel Tampone di Dosaggio (1x). Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio (23) 12/18

14 Tavola 2 Dati tipici relativi all uso del TGF-beta1 umano ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione di TGF-beta1 umano (pg/ml) D.O. (450 nm) Bianco D.O. Media C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione (23) 13/18

15 13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Sensibilità Il limite di rilevamento del TGF-beta1 umano umana definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 8.6 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di TGF-beta 1 umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di TGF-beta1 umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 3.2 %. Tavola 3 La concentrazione media di TGF-beta1 umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione Media TGF-beta1 umano (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%) (23) 14/18

16 Inter-dosaggio La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero e plasma contenenti diverse concentrazioni di TGF-beta1 umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di TGF-beta1 umano ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato era del 8.4 %. Tavola 4 La concentrazione media di TGF-beta1 umano ed il coefficiente di variazione di ogni campione: Campione Concentrazione Media di TGF-beta1 umano (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato addizionando 3 livelli di TGF-beta1 umano al siero, plasma e supernatanti di colture cellulari. I recuperi sono stati determinati nel corso ognuno con 4 replicati. La quantità di TGF-beta1 umano endogeno in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori del test. Vedi Tavola 5 per i dati di recupero. Tavola 5 Matrice del Campione* Test Alto Test Medio Test basso Media (%) intervallo (%) Media (%) intervallo (%) Media (%) intervallo (%) Siero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato) Plasma (Heparina) Supernatanti di colture cellulari * A causa di livelli elevati di TGF-beta1 endogeno, i dati per i concentrazioni addizionati bassi non sono indicati (23) 15/18

17 13.4. Parallelismo della Diluizione Campioni di siero, plasma e supernatanti di colture cellulari con diversi livelli di TGF-beta1 umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Vedi Tavola 6 per i dati di recupero. Tavola 6 Matrice di Campione* Siero 1:60 1:120 Plasma (EDTA) 1:60 1:120 1:240 Plasma (Citrato) 1:60 1:120 1:240 Plasma (Heparina) 1:60 1:120 1:240 Supernatanti di colture cellulari Recupero dei Valori Attesi Diluizione Media (%) Intervallo (%) : :60 1:120 1: Stabilità del Campione Stabilità a Congelamento-Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionato o addizionati) sono state conservate a -20 C e scongelate 5 volte e sono stati determinati i livelli di TGF-beta1 umano. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello TGF-beta1 umano Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionate o non addizionate) sono state conservate a -20 C, 2-8 C ed a temperatura ambiente (TA) ed il livello di TGF-beta1 umano ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del TGF-beta1 umano Specificità Il test rileva TGF-beta1 umano sia naturale, sia ricombinante. La reattività crociata del TGF-beta2 e TGF-beta3, e dei TNF-beta, IL-8, IL-6, IL-2, TNF-α, IL-1beta, IL-4, IFN-γ, IL12p70, IL-5 e IL-10 è stata valutata da addizionando queste proteine a concentrazioni fisiologicamente rilevanti nel siero. Non è stata rilevata alcuna reattività crociata Valori Attesi Per il TGF-beta1 umano è stato testato un pannello di campioni di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). Per i livelli di TGF-beta1 umano misurati vedi la Tavola 7. Tavola 7 Matrice di Numero di Campioni Intervallo Deviazione Standard Media (pg/ml) Campione Esaminati (pg/ml) (pg/ml) Siero Plasma (Citrato) Plasma (EDTA) Plasma (Heparina) (23) 16/

18 14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Per informazioni tecniche contattare: Vedi ultima pagina SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (ml) Coniugato di Biotina Acqua Distillata (ml) Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Streptavidina-HRP Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Fare una diluizione 1:100 di Streptavidina-HRP nella Soluzione Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Streptavidina-HRP (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard TGF-beta1 Umano Ricostituire il standard TGF-beta1 umana liofilizzato con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) (23) 17/18

19 16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 1. Pretrattamento: 1:10 prediluizione (20 μl campione μl Tampone di Dosaggio (1x)), agguingere 20 μl 1N HCI a 200 μl campione prediluito, mescolare ed incubare per 1 ora a temperatura ambiente, aggiungere 20 μl 1N NaOH. 2. Determinare il numero di strip di micropozzetti richiesto. 3. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 4. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 μl di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 μl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 μl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 μl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 μl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 5. Aggiungere 100 μl di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, ai pozzetti del bianco. 6. Aggiungere 60 μl Tampone di Dosaggio (1x) ai pozzetti dei campioni. 7. Aggiungere 40 μl di campioni in duplicato ai pozzetti per i campioni designati. 8. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) 9. Preparare il Coniugato di Biotina. 10. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 5 volte con il Tampone di Lavaggio. 11. Aggiungere 100 μl di Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. 12. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) 13. Preparare la Streptavidina-HRP. 14. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 5 volte con il Tampone di Lavaggio. 15. Aggiungere 100 μl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti. 16. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) 17. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 5 volte con il Tampone di Lavaggio. 18. Aggiungere 100 μl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 19. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 20. Aggiungere 100 μl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 21. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione 1:30 (20 μl di campione μl Tampone di Dosaggio (1x) + 20 µl 1 N HCl + 20 µl 1 N NaOH e 40 µl campione pretrattato + 60 µl Tampone di Dosaggio (1x)), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x30) (23) 18/18

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. CONTENUTI: I reclami possono essere presentati inizialmente scritti o vocali. Successivamente devono essere completati in modo scritto includendo le prestazioni del test ed i risultati se si riferiscono a reclami per ragioni analitiche. GARANZIA: Il prodotto è garantito per essere esente da difetti dei materiali entro la specifica data di conservazione ed in modo conforme alle specifiche fornite con il prodotto. Il prodotto deve essere utilizzato secondo l'uso previsto, tutte le istruzioni riportate nelle istruzioni per l'uso e entro la data di scadenza del prodotto. Qualsiasi modifica della procedura di prova o lo scambio o la miscelazione di componenti di diversi lotti potrebbero avere effetti negativi sui risultati. Questi casi invalidano qualsiasi richiesta di sostituzione. LIMITAZIONE DI RESPONSABILITÀ: IN TUTTE LE CIRCOSTANZE, LA RESPONSABILITÀ DEL FABBRICANTE È LIMITATA AL PREZZO D'ACQUISTO DEL/DEI KIT IN QUESTIONE. IN NESSUN CASO IL PRODUTTORE SARÀ RESPONSABILE PER QUALSIASI DANNO INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE, COMPRESI I DANNI PER PERDITA DI PROFITTO, SALUTE, DANNI PER PERSONE O PROPRIETÀ O ALCUNA ALTRA PERDITA INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 (it) /