PAI-1 ELISA BE C. Istruzioni per l Uso

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1 Istruzioni per l Uso PAI-1 ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa del plasminogeno umano inibitore-1 (PAI-1) nel siero, plasma e supernatanti di colture cellulari umani e altri fluidi biologici. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 5a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D-335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO. SOMMARIO 3. PRINCIPIO DEL TEST 4. REAGENTI FORNITI 3 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 4 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 4 7. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 4 8. PRECAUZIONI PER L USO 5 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROTOCOLLO DI TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO (4) 1/17

3 1 Uso Previsto L ELISA PAI-1 umana è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo della PAI-1 umana. L ELISA PAI-1 umana è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. Sommario Inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1) è l'inibitore primario degli activatori del plasminogeno nel plasma, inattivando rapidamente sia l'attivatore tissueplasminogeno (t-pa) che l'attivatore plasminogeno tipo urokinasi (u-pa). PAI-1 è una glicoproteina a catena singola con un peso molecolare di 47 kilodalton. Durante la fibrinolisi, l'attivante del plasminogeno tissutale (tpa) converte il plasminogeno proteico inattivo in plasmin che svolge un ruolo critico nella fibrinolisi degradando la fibrina e fornendo attività di proteasi in una serie di funzioni fisiologiche. PAI-1 è sintetizzato nel fegato e nelle cellule endoteliali e la sua sintesi è regolata da diversi mediatori fisiologici, includendo endotossina, interleuchina-1, fibroblast growth factor-, andlipids. L inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 è un importante inibitore del sistema fibrinolitico, livelli elevati potrebbero sopprimere la fibrinolisi e il risultato è un aumento del rischio di trombosi. I livelli di PAI-1 aumentati sono stati dimostrati essere associati a un certo numero di fattori di rischio aterosclerotici, PAI-1 ha dovuto agire da fattore protrombico sia nei disturbi arteriosi che venosi. Aumentati livelli di PAI-1 sono associati ad una maggiore incidenza della sindrome coronarica acuta. I livelli PAI-1 sono aumentati anche nei pazienti con patologia arterie coronarica cronica e acuta (CAD) e nei pazienti che soffrono di restenosi dopo la coronaro angioplastica. 3 Principio Del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti-pai-1 umano. Figura 1 Micropozzetto Rivestito La PAI-1umana presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo anti-umana PAI-1 coniugato, che si lega con la PAI- 1umana catturata dal primo anticorpo. Figura Anticorpo do Revestimento Prima Incubazione Standard o Campione Conjugato di Biotina Dopo l incubazione, l anticorpo PAI-1 anti-umana coniugato a biotina non legato viene rimosso durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo PAI-1 anti-umana coniugato a biotina. Figura 3 Seconda Incubazione Streptavidina-HRP (4) /17

4 Dopo l incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP Figura 4 Terza Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di PAI-1 umana presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di PAI-1 umana e si determina la concentrazione del campione di PAI-1 umana Figura 5 Substrato post-reazione 4 Reagenti Forniti 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale anti-human PAI-1 1 flaconcino (70 µl) di anticorpo Biotina-Coniugato (anticorpo monoclonale anti-pai-1 human 1 flaconcino (150 μl) di Streptavidina-HRP flaconcini di Standard di PAI-1 umana liofilizzato, pg/ml se ricostituito. 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 0x (PBS con l 1 % di Tween 0, 10 % di BSA) 1 bottiglia (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 0x (PBS con l 1 % di Tween 0) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Substrato (Tetrametilbenzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido Fosforico 1M) 4 Film adesivi (4) 3/17

5 5 Istruzioni Di Conservazione Conservare i reagenti del kit a -8 C eccetto i controlli. Conservare i controlli liofilizatti a -0 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a -8 C e i controlli a -0 C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6 Prelievo E Conservazione Dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati il sopranatante delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA,citrato, eparina). Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione, rimuovere il siero dal coagulo non appena possibile. Prestare attenzione a un possibile "Effetto Gancio" a causa di alte concentrazioni di campioni (vedi capitolo 11). I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera evidente, o lipemici. campioni devono essere aliquotati e conservati a 0 C sotto zero, per evitare la perdita di PAI-1 umana bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 4 ore, possono essere conservati a una temperatura tra C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. 7 Materiali Necessari Ma Non Forniti - Pipette graduate 5 ml e 10 ml - Micropipette adattabili da 5 μl a 1000 μl a canale singolo, con punte usa e getta - Micropipette adattabili da 50 μl a 300 μl con punte usa e getta - Serbatoio per micropipette multicanale - Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti - Dispositivo per dispensare la soluzione di lavaggio (bottiglia di lavaggio multicanale o sistema di lavaggio automatico) - Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (opzionale: 60 nm lunghezza d onda di riferimento) - Acqua distillata o deionizatta - Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione (4) 4/17

6 8 Precauzioni Per l Uso Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. Non usare i kit dopo la data di scadenza. Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. Non pipettare utilizzando la bocca. Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. Evitare schizzi o produzione di aereosol. Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a 11.5 C. Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido (4) 5/17

7 9 Preparazione Dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli. 9.1 Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio Concentrato (0x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra C e 5 C. Il Tampone di Lavaggio è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tavola seguente: Numero di strisce Tampone di Lavaggio Concentrato (0x) (ml) Acqua distillata (ml) Tampone di Dosaggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (0x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperatura compresa fra C e 8 C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tavola seguente: Numero di strisce Tampone di Dosaggio Concentrato (0x) (ml) Acqua distillata (ml) Preparazione di Coniugato di Biotina Tenere in considerazione che il Coniugato di Biotina deve essere usato entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Coniugato di Biotina con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Streptavidina-HRP Tenere in considerazione che la Streptavidina-HRP deve essere usata entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:00 della soluzione concentrata di Streptavidina-HRP con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Stisce Streptavidina-HRP (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (4) 6/17

8 9.5 Standard PAI-1 Umana Ricostituire lo Standard PAI-1 Umana aggiungendo acqua distillata. Il volume per ricostituire lo standard è indicato sull etichetta del flaconcino dello standard. Centrifugare o mescolare delicatamente per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea (concentrazione dello standard ricostituito = pg/ml). Far ricostituire lo standard per minuti. Mescolare bene prima di procedere alle diluizioni. Dopo l uso, lo standard rimanente non può essere conservato e deve essere eliminato. As diluições do padrão podem ser preparadas diretamente na placa do micropoço (consulte a secção 10.d) ou, em alternativa, em tubos (consulte a secção 9.5.1) Diluizione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto standard. S1, S, S3, S4, S5, S6, S7. Quindi preparare diluizioni seriali 1: per la curva standard come segue: Pipettare 5 μl di Tampone di Dosaggio (1x) in ogni tubo. Pipettare 5 μl di standard ricostituito (concentrazione = pg/ml) nel primo tubo, etichettato come S1, e mescolare (concentrazione dello Standard 1 = 5000 pg/ml). Pipettare 5 μl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S e mescolare accuratamente prima del trasferimento seguente. Ripetere le diluizioni seriali altre 5 volte creando così i punti della curva standard (vedi Figura 6). Il Tampone di Dosaggio (1x) serve come bianco. Figura 6 Transferie 5 µl S1 S S3 S4 - S7 PAI-1 umana Standard ricostituito Soluzione Tampone di Dosaggio 5 µl Eliminare 5 µl (4) 7/17

9 10 Procedura Del Test a. Diluire gli campioni prima di iniziare la procedura 1:50 con il Tampone di Dosaggio (1x) secondo il seguente schema: Diluição: 10 μl campione μl Tampone di Dosaggio (1x) b. Determinare il numero di strip micropozzetti necessario a testare il numero desiderato di campioni, oltre al numero idoneo di pozzetti necessari per eseguire i bianchi e gli standard. Ogni campione, standard, bianco e campione di controllo opzionale dev essere dosato in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non usate e conservarle insieme all essiccante fornito nella bustina metallica, chiusa ermeticamente a una temperatura di -8 C. c. Lavare le strip micropozzetti due volte con un Tampone di Lavaggio di circa 400 μl per ogni pozzetto; aspirare completamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l altro. Prima di aspirare, lasciare il tampone di lavaggio all interno dei pozzetti per circa secondi prima dell aspirazione. Fare attenzione a non scalfire la superficie dei pozzetti. Dopo l ultima fase di lavaggio, svuotare i pozzetti e picchiettare le strip micropozzetti su carta assorbente o su una salvietta di carta per rimuovere il Tampone di Lavaggio in eccesso. Usare le strip micropozzetti immediatamente dopo il lavaggio. In alternativa, le strip micropozzetti possono essere collocate capovolte su una carta assorbente bagnata per non oltre15 minuti. Non lasciar asciugare i pozzetti. d. Diluizione standard sulla piastra per micropozzetti (In alternativa, la diluzione standard si può preparare in tubi - vedi 9.5.1): Aggiungere 100 μl Tampone per Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti degli standard. Pipettare 100 μl di standard preparato (vedi Preparazione dello Standard 9.5, concentrazione = pg/ml), in duplicato, nei pozzetti A1 ed A (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A aspirando ed espellendo ripetutamente (concentrazione dello standard 1 S1 = 5000 pg/ml) e trasferire 100 μl rispettivamente nei pozzetti B1 e B (vedi Figura 7). Fare attenzione a non scalfire la superficie interna dei pozzetti. Ripetere la procedura 5 volte creando due serie di diluizioni standard di PAI-1 umana con un range da 5000 a 78 pg/ml. Eliminare 100 μl del contenuto degli ultimi micropozzetti (G1, G) usati. Figura 7 Transferire 100 µl S1 S S3 S4 - S7 Standard 1:1000 reconstituída PAI-1 Umana Soluzione Tampone di Dosaggio 100 µl Eliminare 100 µl (4) 8/17

10 Nel caso di una diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1), pipettare 100 μl di queste diluizioni dello standard (S1 to S7) nei pozzetti dello standard, come da Tavola 1. Tabela 1 La tavola descrive un esempio dell organizzazione dei bianchi, degli standard e dei campioni nelle strip dei micropozzetti: A B C D E F G Standard 1 (5000 pg/ml) Standard (500 pg/ml) Standard 3 (150 pg/ml) Standard 4 (65 pg/ml) Standard 5 (313 pg/ml) Standard 6 (156 pg/ml) Standard 7 (78 pg/ml) Standard 1 (5000 pg/ml) Standard (500 pg/ml) Standard 3 (150 pg/ml) Standard 4 (65 pg/ml) Standard 5 (313 pg/ml) Standard 6 (156 pg/ml) Standard 7 (78 pg/ml) Standard 1 Standard 1 Standard Standard Standard 3 Standard 3 Standard 4 Standard 4 Standard 5 Standard 5 Standard 6 Standard 6 Standard 7 Standard 7 H Bianco Bianco Standard 8 Standard 8 e. Aggiungere 100 μl di Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) in duplicato ai pozzetti del bianco. f. Aggiungere 50 μl di Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) ai pozzetti del campione. g. Aggiungere 50 μl di ogni campione in duplicato ai pozzetti del campione. h. Preparare il Conjugato di Biotina (vedi 9.3 Preparazione del Coniugato di Biotina). i. Aggiungere 50 μl Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. j. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-5 C) per ore; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. k. Preparare la Streptavidina-HRP (fare riferimento alla preparazione della Streptavidina-HRP 9.4). l. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 3 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. m. Aggiungere 100 μl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco. n. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-5 C) per 1 ora; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. o Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 3 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. p. Pipettare 100 μl di Soluzione di SubstratoTMB in tutti i pozzetti. p. Incubare le strip dei micropozzetti a temperatura ambiente (18-5 C) per circa 10 minuti. Evitare l esposizione diretta a luce intensa. Lo sviluppo cromatico sulla piastra dev essere monitorato e la reazione del substrato dev essere bloccata (vedi prossimo punto di questo protocollo) prima che i valori dei pozzetti positivi non siano più correttamente registrabili. Il periodo ideale di tempo necessario per lo sviluppo del colore dev essere determinato individualmente per ogni dosaggio (4) 9/17

11 r Si raccomanda di aggiungere la soluzione bloccante quando lo standard più alto ha raggiunto un colore blu scuro. In alternativa, lo sviluppo del colore può essere monitorato con il lettore ELISA a 60 nm. La reazione del substrato dev essere bloccata non appena lo Standard 1 ha raggiunto un DO di Bloccare la reazione dell enzima pipettando velocemente 100 μl di Soluzione Bloccante in ogni pozzetto. E importante che la Soluzione Bloccante venga distribuita velocemente ed uniformemente su tutti i pozzetti per inattivare completamente l enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l aggiunta della Soluzione Bloccante, o entro 1 ora se le strip dei micropozzetti sono conservate al buio e ad una temperatura di -8 C. s. Leggere l assorbanza di ogni micropozzetto con uno spettrofotometro usando 450 nm. come lunghezza d onda primaria (in alternativa, 60 nm. come lunghezza d onda di riferimento; da 610 nm a 650 nm. il valore è accettabile). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e usando i pozzetti del bianco. Determinare l assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Nota: In caso di incubazione senza aver agitato le sostanze i valori della D.O. ottenuti possono essere inferiori a quelli indicati qui di seguito. Tuttavia i risultati sono ancora validi. 11 Calcolo Dei Risultati Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 0 % del valore medio. Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di PAI-1 umana sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). Per determinare la concentrazione di PAI-1 circolante umana per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di PAI-1 umana. Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti 1: 100 (50 µl campione + 50 µl Tampone di Dosaggio (1x)),. La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione(x 100) Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di PAI-1 umana (Effetto Gancio). Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati della PAI-1 umana, con un Tampone per Dosaggio (1x) in modo da quantificare con precisione i livelli reali di PAI-1 umana. Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di PAI-1 umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio (4) 10/17

12 Figura 8 Curva standard rappresentativa per il PAI-1 umana ELISA. La PAI-1 umana è stata diluita in fasi seriali nel Tampone di Dosaggio (1x). Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Tavola Dati tipici relativi all uso del PAI-1 Umana ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 60 nm Standard Concentrazione di PAI-1 Umana (pg/ml) D.O. (450 nm) Bianco D.O. (450 nm) Media C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi (4) 11/17

13 1 Limiti Della Procedura - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può causare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunte al campione. 13 Caratteristiche Di Prestazione 13.1 Sensibilità Il limite di rilevamento della PAI-1 umana definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più deviazioni standard), è stato determinato di 9.0 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti). 13. Riproducibilità Intra-dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di PAI-1 umana. Per ogni micropiastra sono state create curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di PAI-1 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 4.7 % (4) 1/17

14 Tavola 3 La concentrazione media di PAI-1 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione Media PAI-1 Umana (ng/ml) Coefficiente di Variazione (%) Inter-dosaggio La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di PAI-1 umana. Per ogni micropiastra sono state create curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di PAI-1 umana ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato è del 5.0 %. Tavola 4 La concentrazione media di PAI-1 umana ed il coefficiente di variazione di ogni campione: Campione Concentrazione Media di Coefficiente di PAI-1 Umana (ng/ml) Variazione (%) (4) 13/17

15 13.3 Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 4 livelli di PAI-1 umano al siero e plasma. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 4 replicati. La quantità di PAI-1 umano endogeno in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori del test. Il recupero variava dal 64,5% al 84,8% con un recupero medio complessivo del 7,% per il siero e tra il 44,8% e il 68,4% con un recupero medio complessivo del 58,7% per i campioni di plasma Parallelismo della Diluizione I campioni di siero con diversi livelli di PAI-1 umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 91.9 % al % con un recupero medio complessivo del 98.7 % (vedi Tavola 5). Tavola 5 Campione Diluizione Concentrazione Attesa di PAI-1 umana (ng/ml) Concentrazione Misurata di PAI-1 umana (ng/ml) Recupero di Concentrazione Attesa di PAI-1 (%) Stabilità del Campione Stabilità a Congelamento-Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionate o addizionate) sono state conservate a -0 C e scongelate 5 volte e sono stati determinati i livelli di PAI-1 umana. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello PAI-1 umana Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionate o non addizionate) sono state conservate a -0 C, -8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e dopo 4 ore ne è stato determinato il livello di PAI-1 umana. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dell PAI-1 umana Specificità Il saggio rileva sia umana PAI-1 in forme naturali e ricombinanti. L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero positivo PAI-1 umana. Non è stata rilevata alcuna cross-reattività (4) 14/17

16 13.7 Valori Attesi Un gruppo di donatori apparentemente sani, selezionati in modo casuale (maschile e femminile) è stata messa alla prova quando il PAI-1 umano. I livelli scoperto PAI-1 umano per sieri variava tra 1. e 86.0 ng/ml con un livello medio di 41.9 ng/ml per il plasma (EDTA) da 0.0 a ng/ml con un livello medio di 14.1 ng/ml al plasma (eparinato) tra 0.9 e 99.0 ng/ml con un livello medio di.9 ng/ml e plasma (citrato) tra.4 e 43.8 ng/ml con un livello medio di 17.9 ng/ml. 14 Informazioni Per Gli Ordini Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. 15 Sommario Di Preparazione Dei Reagenti 15.1 Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 0x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Acqua Distillata (ml) 15. Soluzione Tampone di Dosaggio Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 0x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (ml) Coniugato di Biotina Acqua Distillata (ml) Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Streptavidina-HRP Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Fare una diluizione 1:00 di Streptavidina-HRP nella Soluzione Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Standard PAI-1 Umana Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Ricostituire lo standard PAI-1 umana liofilizzato con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) (4) 15/17

17 16 Sommario Di Procedura Del Test 1 Prediluire i campioni Tampone di Dosaggio (1x) 1:50. Determinare il numero di strip di micropozzetti richiesto. 3 Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 4 Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 μl di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 μl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 μl da pozzetto a pozzetto. Eliminare 100 μl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 μl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 5 Aggiungere 100 μl di Tamponi di Dosaggio(1x), in duplicato, ai pozzetti del bianco. 6 Aggiungere 50 μl Tampone di Dosaggio (1x) ai pozzetti dei campioni. 7 Aggiungere 50 μl di duplicato ai pozzetti per i campioni diluta designati. 8 Preparare il Coniugato di Biotina. 9 Aggiungere 50 μl di Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. 10 Coprire le strip dei micropozzetti ed incubare per due ore (18-5 C). 11 Preparare la Streptavidina-HRP. 1 Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio. 13 Aggiungere 100 μl di Streptavidina-HRP diluta a tutti i pozzetti. 14 Coprire le strisce di micropozzetti ed incubare per 1 ora a temperatura ambiente (18-5 C). 15 Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio. 16 Aggiungere 100 μl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 17 Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-5 C). 18 Aggiungere 100 μl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 19 Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti 1: 100 (50 µl campione + 50 µl Tampone di Dosaggio (1x)),. La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione(x 100) (4) 16/17

18 17 Riferimenti Bibliografici Sul Prodotto 1) Adcock DM, Kressin DC, and Marlar RA, Effect of 3.% vs 3.8% Sodium Citrate Concentration on tine Coagulation Testing, Am J Clin Pathol, 1997, 107(1): ) Reneke J, Etzell J, Leslie S, et al, Prolonged Prothrombin Time and Activated Partial Thromboplastin Time Due to Underfilled Specimen Tubes With 109 mmol/l (3.%) Citrate Anticoagulant, Am J Clin Pathol, 1998, 109(6): ) National Committee for Clinical Laboratory Standardization: Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing and General Performance of Coagulation Assays; Approved Guideline, Third Edition, Villanova: NCCLS Document H1-A3:11(3), ) Gottfried EL and Adachi MM, Prothrombin Time and Activated Partial Thromboplastin Time Can Be Performed on the First Tube, Am J Clin Pathol, 1997, 107(6): ) McGlasson DL, More L, Best HA, et al, Drawing Specimens for Coagulation Testing: Is a Second Tube Necessary? Clin Lab Sci, 1999, 1(3): ) Huber K, Christ G, Wojta J, et al, Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 in Cardiovascular Disease, Status Report 001, Thromb Res, 001, 103(Suppl 1):S7-S19. 7) Huber K, Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 (Part One): Basic Mechanisms, Regulation, and Role for Thromboembolic Disease, J Thromb Thrombolysis, 001, 11(3): (review). 8) Huber K, Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 (Part Two): Role for Failure of Thrombolytic Therapy. PAI-1 Resistance as a Potential Benefit for New Fibrinolytic Agents, J Thromb Thrombolysis, 001, 11(3):195-0 (review) (4) 17/17

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20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. CONTENUTI: I reclami possono essere presentati inizialmente scritti o vocali. Successivamente devono essere completati in modo scritto includendo le prestazioni del test ed i risultati se si riferiscono a reclami per ragioni analitiche. GARANZIA: Il prodotto è garantito per essere esente da difetti dei materiali entro la specifica data di conservazione ed in modo conforme alle specifiche fornite con il prodotto. Il prodotto deve essere utilizzato secondo l'uso previsto, tutte le istruzioni riportate nelle istruzioni per l'uso e entro la data di scadenza del prodotto. Qualsiasi modifica della procedura di prova o lo scambio o la miscelazione di componenti di diversi lotti potrebbero avere effetti negativi sui risultati. Questi casi invalidano qualsiasi richiesta di sostituzione. LIMITAZIONE DI RESPONSABILITÀ: IN TUTTE LE CIRCOSTANZE, LA RESPONSABILITÀ DEL FABBRICANTE È LIMITATA AL PREZZO D'ACQUISTO DEL/DEI KIT IN QUESTIONE. IN NESSUN CASO IL PRODUTTORE SARÀ RESPONSABILE PER QUALSIASI DANNO INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE, COMPRESI I DANNI PER PERDITA DI PROFITTO, SALUTE, DANNI PER PERSONE O PROPRIETÀ O ALCUNA ALTRA PERDITA INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE. IBL International GmbH Flughafenstr. 5A, 335 Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 (it) /