alpha-amylase Saliva Assay

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1 Istruzioni per l Uso alpha-amylase Saliva Assay Saggio enzimatico per la determinazione dell attività dell alfa-amilasi nella saliva umana. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) [email protected] D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PREVISTO Saggio enzimatico per la determinazione dell attività dell alfa-amilasi nella saliva umana. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI La misurazione dell attività dell alfa-amilasi nella saliva è utile nel campo della psicobiologia dello stress. Numerosi studi hanno dimostrato che l attività dell alfa-amilasi nella saliva è correlata all attività del sistema Simpatico-Adrenale-Midollare. Il cortisolo libero salivare è un marcatore affidabile e non invasivo dell attività dell asse ipotalamo-pituitariosurrenale (HPA). Oggi l alfa-amilasi salivare sembra rappresentare un marcatore altrettanto ben caratterizzato dell attività del sistema simpatico-midollare del surrene (SAM). L alfa-amilasi salivare sembra anche essere correlata a stress cronico, disturbo post-traumatico da stress, comportamento, funzioni cognitive e salute. Si può inoltre ottenere un aumento dell alfa-amilasi salivare con farmaci attivatori dell SNS (come la yohimbina) e prevenirlo con beta-bloccanti (come il propranololo). L'attuale stato della ricerca mostra che alpha Amilasi nella saliva potrebbe essere un utile estensione dei metodi psicobiologici. 3. PRINCIPIO DEL TEST Questo saggio è un saggio enzimatico in fase liquida. L alfa-amilasi salivare metabolizza specificamente il substrato. L intensità del colore che si sviluppa è proporzionale all attività dell alfa-amilasi nel campione. Il risultato dei campioni si può determinare direttamente facendo uso della curva standard. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Il personale delle pulizie dev essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare. 9. Alcuni reagenti contengono azido di sodio (NaN 3 ) come conservante. In caso di contatto con occhi e pelle risciacquare subito abbondantemente. NaN 3 potrebbe reagire con piombo e rame piombato formando metalli azidici esplosivi. Quando si eliminano i reagenti provvedere a bagnarli con grandi quantità di acqua per evitare formazione di azidi. 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. Version / 6

3 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Saliva Il paziente non dovrebbe bere, mangiare, masticare gomme o lavarsi i denti nei 30 minuti che precedono il prelievo dei campioni. In caso una delle precedenti cose fosse stata fatta far risciascquare la bocca a fondo con acqua fresca 5 minuti prima del prelievo del campione. Non prelevare il campione in caso di infezioni del cavo orale, infiammazioni o lesioni (contaminazione da sangue). La saliva può essere raccolta in un apposito contenitore. Raccogliere un minimo di 0.5 ml di saliva. La salivazione può essere stimolata masticando un pezzo di Parafilm. Si consiglia di congelare il campione prima del test a 20 C. Mescolare e centrifugare Dopo scongelamento centrifugare 10 min a x g per rimuovere il materiale particolato. Controllare l aspetto della saliva. (Colorazione rosata o rossastra - indice di presenza di sangue) Conservazione C 2 8 C -20 C (Aliquote) Stabilità 1 giorno 28 giorni 6 mesi 7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 3 x 200 µl CAL LYO 2 x 3 x 200 µl CONTROL 1 LYO CONTROL 2 LYO 1 x 40 ml DILBUF CONC 1 x 21 ml SUBS Micropiastra Strisce separabili. Standard dalla concentrazione stock, liofilizzato Contiene: alfa-amilasi salivare umana. Metodo di riferimento per la taratura: fotometro temperato. Per le concentrazioni esatte vedere le etichette sulle provette o il certificato di Controllo Qualità. Controllo 1+2, liofilizzato Contiene: alfa-amilasi salivare umana. Metodo di riferimento per la taratura: fotometro temperato. Per le concentrazioni esatte vedere le etichette sulle provette o il certificato di Controllo Qualità. Campione, Concentrato (10x) Contiene: PBS, BSA, stabilizzatori. Soluzione Substrato Pronto/a all uso. Contiene: CNPG3, stabilizzatori. 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 10; 100; 200; 1000 µl 2. Provette usa e getta per diluizione dei campioni 3. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti 4. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 405 nm (lunghezza d onda di riferimento nm) 5. Acqua bidistillata o deionizzata 6. Carta assorbente, puntali per pipette e timer 7. Vortex mixer 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. Version / 6

4 4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento. 5. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un appropriata distribuzione sulla piastra. 6. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. 7. L alfa-amilasi si trova nel sudore e nella saliva. Indossare i guanti durante il dosaggio e non pipettare con la bocca. 10. ISTRUZIONI PRE-TEST Preparazione di componenti concentrati Componente Rapporto Diluente Note Conservazione Stabilità Campione DILBUF CONC 1:10 acqua bidist. p.e. 10 ml Campione + 90 ml acqua bidist. Mescolare senza formare schiuma. 2-8 C 4 settimane Preparazione di Componenti liofilizzati Componente con Diluente Note Conservazione Stabilità CAL LYO 200 µl Lasciare a riposo per 15 min. 2-8 C 7 giorni CONTROL 1+2 LYO 200 µl Mescolare senza formare schiuma. 2-8 C 7 giorni Preparazione degli standard Lo standard ricostituito dalla concentrazione stock dev essere diluito in proporzione 1:301. Questo è lo standard 1. Successivamente, una soluzione seriale permette di ottenere standard con diverse concentrazioni. L esempio qui di seguito mostra come ottenere una curva standard con 5 punti di taratura. Nome Rapporto Diluente Note Standard 1 1:301 Standard 2 1:2 Standard 3 1:2 Standard 4 1:2 Standard 5-10 µl di standard da stock ricostituito + 3 ml. Miscelare bene prima di una nuova diluizione. 100 µl Standard µl Miscelare bene prima di una nuova diluizione 100 µl Standard µl Miscelare bene prima di una nuova diluizione 100 µl Standard µl Miscelare bene. Calculazione U/mL Vedi etichettatura e.g.: 400 U/mL e.g.: 200 U/mL e.g.: 100 U/mL e.g.: 50 U/mL Solo tampone di campione diluito 0 U/mL Pre-diluizione di Controlli e Campioni I campioni devono essere pre-diluiti fino alla proporzione 1:301 come segue: Rapporto Diluente Note Campione 1:301 p.e.: 10 µl Campione (Saliva) + 3 ml. Miscelare bene dopo la diluizione. Controlli 1:301 p.e.: 10 µl Controllo (ricostituito) + 3 ml. Miscelare bene dopo la diluizione. Campioni con concentrazioni superiori allo standard più alto devono essere ulteriormente diluiti. Version / 6

5 11. PROCEDURA DEL TEST 1. Pipettare 10 µl di ogni Standard pre-diluito, dei Controlli pre-diluiti e del Campione pre-diluito nei rispettivi pozzetti del Vassoio di Microprovette 2. Pipettare 200 µl di Soluzione Substrato in ogni pozetti. Agitare delicatamente la piastra. 3. Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8-canali. Usare uno spostamento positivo ed evitare la formazione di bolle d aria. 4. Incubare 3 min a temperatura ambiente (18-25 C). 5. Misurazione 1: Misurare la densità ottica con un fotometro a 405 nm (Lunghezza d onda di riferimento: nm) 6. Durante l incubazione l alfa-amilasi presente nel campione metabolizzerà specificamente il substrato. E importante ottenere una buona differenziazione tra gli standard. Tuttaviail valore di assorbanza (DO) dello standard massimo, ottenuto per la seconda misurazione, non deve superare Seguire lo sviluppo del valore (DO) in tempi diversi, per evitare il suo superamento. Questo è particolarmente importante nel caso di temperatura ambiente elevata. Il risultato dell attività dell alfaamilasi non ne verrà influenzato! 7. Incubare altri 5 min (tempo totale d incubazione 8 min) a temperatura ambiente (18-25 C). In caso di temperatura ambiente elevata o di primo uso del dosaggio si raccomanda di misurare il vassoio una volta in più, dopo 3 min (tempo totale d incubazione 6 min.). 8. Misurazione 2: Misurare la densità ottica con un fotometro a 405 nm (Lunghezza d onda di riferimento: nm) 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati sono validi solo se si sono seguite le istruzioni d uso del test. L utilizzatore deve attenersi alle Buone Regole di Procedura di Laboratorio (Good Laboratory Practice) o ad altri standard/regolamenti applicabili. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette delle fiale. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni di incubazione e metodi di lavaggio. 13. CALCOLO DEI RISULTATI Calcolare il delta DO per ogni standard, ogni controllo ed ogni campione deducendo il valore DO della Misurazione 1 dal valore OD della Misurazione 2. Il delta DO degli standard così ottenuto (asse y, lineare) è tracciato in funzione della loro concentrazione (asse x, logaritmico) o su carta per grafico semilogaritmico o con un metodo automatizzato. Un buon sistema è costituito dalla spline cubica, dal Modello Logistico a 4 Parametri o Logit-Log Per il calcolo della curva standard applicare ogni delta DO degli standard (si può omettere un ovvio valore outlier ed usare il valore singolo più plausibile). L attività dell alfa-amilasi nei campioni e nei controlli si può leggere direttamente dalla curva standard. I risultati di campioni di pre-diluizioni più elevate devono essere moltiplicati per il fattore di diluizione. I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati. Potete contattare IBL per assistenza nel calcolo dei risultati. I risultati sono espressi in U/mL. Per convertire il Sistema Internazionale (SI) di Unità moltiplicare per il fattore di conversione I reisultati saranno allora espressi in nkat/l. Version / 6

6 14. PERFORMANCE Precisione Recupero Media Attività SD Intra-Saggio Inter-Saggio Campione Saliva Diluizione Misurato Attività Recupero (%) 1: : : : : : Linearità 1: : : : : : : : : Attività endogena Aggiunto Attività Misurato Attività Recupero (%) Saliva (25.5) Confronto del metodo Saliva 2 (38.9) Saliva 3 (107.1) CV (%) IBL = x Saggio enzimatico disponibile in commercio N r = n = 24 Version / 6

7 15. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. DIN EN ISO 18153:2003, In vitro diagnostic medical devices Measurement of quantities in biological samples Metrological traceability of values for catalytic concentration of enzyme assigned to calibrators and control materials. 2. Emily S. Winn-Deen, Harold David, Gerald Sigler, Rodrigo Chavez; Development of a Direct Assay for alpha-amylase ; Clin. Chem. 34/10, (1988) 3. Jean-Pierre Bretaudiere, Robert Rej, Patricia Drake, Anne Vassault, Michel Bailly Suitability of Control Materials for Determination of alpha-amylase activity ; Clin. Chem. 27/6, (1981) 4. G. Gubern, F. Canalias, FJ Gella; Determination of alpha-amylase activity: method comparison and commutability study of several control material ; Clin. Chem. 41, (1995) 5. Urs M. Nater, Nicolas Rohleder, Wolff Schlotz, Ulrike Ehlert, Clemens Kirschbaum; Determinants of the diurnal course of salivary alpha-amylase ; Psychoneuroendocrinology 32, (2007) 6. Daniela Schoofs, Diana Preuß, Oliver T. Wolf; Psychosocial stress induces working memory impairments in an n-back paradigm ; Psychoneuroendocrinology 33, , (2008) 7. Tom Smeet, Henry Otgaar, Ingrid Candel, Oliver T. Wolf; True or false? Memory is differentially affected by stress-induced cortisol elevations and sympathetic activity at consolidation and retrieval ; Psychoneuroendocrinology 33, (2008) 8. Katrin Starcke, Oliver Wolf; Anticipatory Stress Influences Decision Making Under explicit Risk Conditions ; Behavioral Neuroscience, 122/ 6, (2008) 9. Noriyasu Takai, Masaki Yamaguchi, Toshiaki Aragaki, Kenji Eto, Kenji Uchihashi and Yasuo Nishikawa; Gender-Specific Differences in Salivary Biomarker Responses to Acute Psychological Stress ; New York Academy of Sciences 1098: (2007) 10. Anda van Stegeren, Nicolas Rohleder, Walter Everaerda and Oliver T. Wolf; Salivary alpha amylase as marker for adrenergic activity during stress: Effect of betablockade ; Psychoneuroendocrinology 31, (2006) 11. Ulrike Ehlert, Katja Erni, Gundula Hebisch, and Urs Nater; Salivary α-amylase Levels after Yohimbine Challenge in Healthy Men ;The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 91(12): (2006) Version / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: [email protected] WEB: Symbols Version 4.5 /