Epstein-Barr virus EBNA-1 IgG ELISA

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1 Istruzioni per l Uso Epstein-Barr virus EBNA-1 IgG ELISA Saggio immunoenzimatico per la determinazione qualitativa o quantitativa degli anticorpi della classe IgG contro I antigene nucleare (EBNA-1) del virus d Epstein-Barr nel siero e plasma umani. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) [email protected] D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PREVISTO Saggio immunoenzimatico per la determinazione qualitativa o quantitativa degli anticorpi della classe IgG contro I antigene nucleare (EBNA-1) del virus d Epstein-Barr nel siero e plasma umani. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI La mononucleosi infettiva è una patologia linfoproliferativa acuta comune nei bambini e giovani adulti ed è causata dal virus Epstein-Barr (EBV). L EBV è una delle infezioni da gamma-herpesvirus tipo 4. La sintomatologia clinica caratteristica include: 1. febbre, faringite e linfoadenopatia 2. una linfocitosi assoluta associata e con valori superiori al 50% contenenti almeno il 10% di linfociti atipici nel sangue periferico 3. sviluppo di anticorpi eterofili transienti e presenza persistente di anticorpi anti EBV 4. test sull alterazione della funzionalità epatica il 4% dei giovani adulti infetti presentano un ittero e il 50% presenta anche splenomegalia. L EBV è inoltre correlato al carcinoma rinofaringeo, al linfoma di Burkitt e di Hodgkin. Una sindrome simile a quella della mononucleosi infettiva può essere causata dal citomegalovirus, dalla toxoplasmosi e da altre infezioni virali; la diagnosi differenziata dipende dai risultati di laboratorio, considerando solo l EBV come stimolante della produzione di anticorpi eterofili. L EBV è presente nella saliva di pazienti che hanno contratto una mononucleosi infettiva acuta e la secrezione del virus da parte dell orofaringe, che continua per molti mesi dopo la fase acuta della patologia, è una delle principali vie di trasmissione del virus. Il virus di Epstein-Barr, dopo aver contratto l infezione, rimane in circolo per tutta la vita, per quanto in generale - a livello asintomatico. Nei Paesi in via di sviluppo praticamente l intera popolazione è infettata; nei Paesi occidentali vi è una prevalenza circa dell 80 90%. La trasmissione, probabilmente dalla madre, avviene già in età infantile e principalmente tramite la saliva. Di grande importanza per la diagnosi è il riscontro di un aumento del numero relativo ed assoluto di linfociti e di linfociti atipici. Durante il decorso della malattia il 50 60% dei leucociti nel sangue periferico può consistere di cellule linfatiche, delle quali normalmente il 10% consiste di linfociti atipici. Inoltre si osservano test sulla funzionalità epatica anormali ed alti titoli di anticorpi eterofili. Test sierologici come Elisa sono molto utili per la determinazione di anticorpi anti-ebv, specialmente se gli anticorpi eterofili sono assenti. Le diverse fasi di un infezione EBV (primoinfezione acuta, infezione riattivata, infezione passata) sono caratterizzate dalla comparsa di diversi anticorpi (IgA, IgG, IgM) anti-antigeni virali diversi (antigene virocapsidico = VCA, antigene precoce = EA e l antigene nucleare del virus di Epstein-Barr = EBNA). I sei parametri prodotti dall IBL (VCA IgA / IgG / IgM, EA IgA / IgG und EBNA IgG) permettono di individuare e differenziare tutte le fasi di un infezione EBV. Con una selezione mirata di antigeni IBL EBV ELISA si otterrà una straordinaria sensibilità e specificità ai fini della diagnosi di patologie acute e del riscontro di infezioni passate. I dosaggi per il rilevamento di anticorpi anti EA ed EBNA usano antigeni ricombinanti altamente specifici l antigene EA p54 espresso in E. Coli e l antigene EBNA-1 p72 espresso in cellule Sf9; VCA gp125 purificato da cellule P3HR1 è responsabile dell alta sensibilità dei VCA ELISA. Questa selezione di antigeni insieme ad una regolazione mirata delle caratteristiche del dosaggio porta ad una chiara distinzione tra campioni positivi e negativi, vale a dire una piccola zona grigia. L altissima sensibilità del dosaggio VCA IgA e la specificità pari al 100% dell EA IgA ELISA rivestono particolare importanza; La combinazione di questi due dosaggi permette un rilevamento corretto, estremamente affidabile, di infezioni riattivate. Il principio di µ-cattura applicato ai risultati del dosaggio VCA IgM porta ad una maggiore specificità se paragonato ai test IgM ELISA basati sul principio del sandwich; questo significa che i falsi risultati positivi vengono minimizzati. Nel capitolo PERFORMANCE, si trovano le informazioni sulle combinazioni di anticorpi tipiche delle diverse fasi di un infezione. Version / 8

3 3. PRINCIPIO DEL TEST Test dell immunosorbente legato ad un enzima (ELISA) in fase solida, basato sul principio del sandwich. L antigene EBV EBNA (antigene ricombinante EBNA-1 p72 espresso in cellule Sf9) è legato sulla superficie delle strip delle microprovette. Il siero diluito del paziente o il calibratore ed i controlli pronti all uso vengono pipettati nei pozzetti del vassoio delle microprovette. Durante la prima incubazione gli anticorpi IgG dei campioni si legano all antigene immobilizzato. Durante la seconda incubazione viene aggiunto il coniugato di perossidasi anti IgG umani che si lega agli anticorpi IgG catturati nei pozzetti delle microprovette. Successivamente si pipetta il substrato (TMB) che induce lo sviluppo di una colorazione blu nei pozzetti. Lo sviluppo della colorazione viene bloccato da una soluzione stop che modifica il colore da blu a giallo. Ne risulta una colorazione valutabile al lettore spettrofotometrico su una lunghezza d onda di 450 nm. La concentrazione degli anticorpi IgG è direttamente proporzionale all intensità della colorazione. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Il personale delle pulizie dev essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare. 9. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle. 10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi. 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. L informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. La piastra microtitrata aperta è stabile 4 settimane se conservata nel suo involucro ben chiuso riposta a 2 8 C. 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Siero, Plasma (EDTA, Citrato) Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l integrità del campione di sangue dal momento del prelievo al momento dell esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro interno. Conservazione: 2-8 C -20 C Non esporre alla luce solare diretta e al calore. Stabilità: 7 giorni > 7 giorni Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento. Version / 8

4 7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 15 ml IgG CONJ 1 x 1.5 ml CONTROL+ 1 x 1.5 ml CONTROL- 1 x 4 x 1.5 ml CAL A-D 1 x 100 ml DILBUF 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Micropiastra Strisce separabili. Ricoperta con antigene specifico. IgG Coniugato Enzimatico Di colore verde. Pronto/a all uso. Contiene: antiumano IgG, coniugato a perossidase. Controllo Positivo Di colore rosso. Pronto/a all uso. Contiene: IgG anticorpi contro EBV EBNA-1 (Siero umano), stabilizzatori. Controllo Negativo Di colore verde.. Pronto/a all uso. Contiene: IgG anticorpi contro EBV EBNA-1 (Siero umano), stabilizzatori. Standard A-D 2; 20; 50; 200 U/mL Standard B = Standard Cut-off. Pronto/a all uso. Contiene: IgG anticorpi contro EBV EBNA-1 (Siero umano), stabilizzatori. Tampone Diluente Pronto/a all uso. Contiene: PBS Tampone, detergenti, BSA, stabilizzatori. Tampone Lavaggio, Concentrato (10x) Contiene: PBS Tampone, detergenti. Soluzione Substrato TMB Pronto/a all uso. Contiene: TMB, Tampone, stabilizzatori. Soluzione Stop TMB Pronto/a all uso. 0.5 M H 2SO MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 5; 100; 500 µl 2. Vortex mixer 3. Tubi per diluizione dei campioni 4. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti 5. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico 6. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento nm) 7. Acqua bidistillata o deionizzata 8. Incubatore, 37 C 9. Carta assorbente, puntali per pipette e timer 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un appropriata distribuzione sulla piastra. 5. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. Version / 8

5 6. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti. 7. L umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l involucro finché non ha raggiunto la temperatura ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell involucro con il disseccante. 10. ISTRUZIONI PRE-TEST Preparazione dei Componenti Diluire / dissolvere 100 ml Componente Diluente Rapporto Note Conservazione Stabilità WASHBUF CONC fino a 1000 ml Diluizione dei Campioni acqua bidist. 1:10 Riscaldare a 37 C per sciogliere i cristalli. Mescolare energicamente. 2-8 C Campione da diluire con Rapporto Note 8 settimane Siero / Plasma sempre DILBUF 1:101 p.e. 5 µl µl DILBUF Campioni con concentrazioni superiori allo standard più alto devono essere ulteriormente diluiti. 11. PROCEDURA DEL TEST 1. Pipettare rispettivamente 100 µl di Standard, Controlli e campioni diluiti nei rispettivi pozzetti della Micropiastra. Nel test qualitativo usare solo Standard B (Standard Cut-off). Per una maggiore affidabilità dell analisi si possono duplicare le determinazioni. 2. Coprire la piastra con foglio adesivo. Incubare 60 min a 37 C. 3. Rimuovere il foglio adesivo. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 3 x 300 µl / pozzetto con il Tampone di Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 4. Pipettare 100 µl di Coniugato Enzimatico in ogni pozzetto. 5. Coprire la piastra con foglio adesivo. Incubare 60 min a 37 C. 6. Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 3 x 300 µl / pozzetto con il Tampone di Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 7. Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8-canali. Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Stop e Substrato. Usare uno spostamento positivo ed evitare la formazione di bolle d aria. 8. Pipettare 100 µl di Soluzione Substrato TMB in ogni pozzetto. 9. Incubare 30 min a C al buio (senza foglio adesivo). 10. Fermare la reazione substrato aggiungendo 100 µl di Soluzione Stop TMB in ogni pozzetto. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. 11. Misurare la densità ottica con un fotometro a 450 nm (Lunghezza d onda di riferimento: nm) 60 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop. 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati sono validi solo se si sono seguite le istruzioni d uso del test. L utilizzatore deve attenersi alle Buone Regole di Procedura di Laboratorio (Good Laboratory Practice) o ad altri standard/regolamenti applicabili. Tutti gli standards del kit devono rientrare nei limiti di accettabilità dichiarati sul certificato di Controllo Qualità. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi di controllo qualità periodici. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni di incubazione e metodi di lavaggio. Version / 8

6 13. CALCOLO DEI RISULTATI L evaluazione del test può essere eseguita qualitativamente o quantitativamente Evaluazione Qualitativa Il valore di Cut-off è fornito dalla densità ottica (DO) dello Standard B (Standard Cut-off). L indice Cut-off (COI) è calcolato sulla base della densità ottica media dei campioni e del valore Cut-off. Campioni la cui densità ottica non differisca più del 10% dal Cut-off (zona grigia) vanno considerati dubbi. Campioni con DO superiore sono positivi, campioni con DO inferiori sono negativi. Esempio Tipico: Cut-off = DO (Standard B, Standard Cut-off) = 0.55 DO Campione = 0.70 Indice Cut-off (COI): 0.70 / 0.55 = Il campione va considerato positivo Evaluazione Quantitativa Le DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione (asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log. Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile). La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard. La diluizione iniziale è stata presa in considerazione quando si sono letti i risultati sul grafico. I risultati di campioni con prediluizioni superiori devono essere moltiplicati per il fattore di diluizione. I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standard devono essere diluiti come descritto nel paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati. Tipica Curva di Calibrazione (Esempio. Non usare per il calcolo!) Standard U/mL DO Media A B C D (OD) Epstein-Barr virus EBNA-1 IgG ELISA (U/mL) 14. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Metodo Intervallo Interpretazione > 22 U/mL positivo Quantitativo U/mL dubbio (Curva Standard): < 18 U/mL negativo Qualitativo (Cut-off Index, COI): > 1.1 positivo dubbio < 0.9 negativo I soli risultati non dovrebbero essere l unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici. 15. LIMITI DELLA PROCEDURA La raccolta e conservazione dei campioni ha influenza significativa sui risultati del test. Vedere la sezione PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI per maggiori dettagli. Azide e thimerosal a concentrazioni > 0.1 % interferiscono con questo test e possono portare a risultati non veritieri. I seguenti componenti del sangue non influenzano Emoglobina 2.0 mg/ml significativamente (+/-20% del valore atteso) I risultati del test Bilirubina 0.3 mg/ml fino alle concentrazioni indicate di seguito: Trigliceridi 2.5 mg/ml Version / 8

7 16. PERFORMANCE Specificità Analitica (Reattività Crociate) Precisione Non è stata riscontrata reattivitàcrociate con: (n = 3-12) Intervallo ± 1xSD (U/mL) CV (%) Anticorpi contro Parvovirus B19, VZV, HSV 1, CMV, Morbillo, Parotite, Toxoplasmosis, Rosolia Intervallo ± 1xSD (U/mL) CV (%) Intervallo ± 1xSD (U/mL) Intra-Saggio (n = 20) 386 ± ± ± 1 8 Inter-Saggio (n = 20) 98 ± ± ± 3 21 Inter-Lot (n = 20) 100 ± ± ± 3 15 Linearità Intervallo (U/mL) Intervallo di Diluizione (specifico per il campione) Intervalo di rec. (%) :2-1: Automazione Questo test è stato calibrato per: BEPIII (Dade Behring), TRITURUS (Grifols) Per determinare la sensibilità e specificità clinica di tutti i parametri 6 IBL EBV ELISA un pannello di 242 campioni è stato testato in tutti i dosaggi. Questo pannello contiene campioni delle diverse fasi di un infezione EBV: Sieronegativa (compresi campioni di bambini) n = 64 Fase acuta di un infezione n = 48 Infezione Riattivata n = 55 Infezione passata n = 75 La classificazione dei campioni è stata approvata da immunofluorescenza (IFA), in particolare i campioni dell infezione riattivata. Per la comparazione dei metodi tutto il pannello è stato misurato con ELISA per EBNA IgG, VCA IgG, VCA IgM ed EA IgG approvati dalla FDA (Food and Drugs Administration, U.S.A.) Per EA IgA and VCA IgA non esiste approvazione ufficiale del FDA. CV (%) Campioni determinati come positivi (compresi i border-line) con ELISA-IBL n = 242 fase acuta di un infezione n = 48 infezione riattivata n = 55 infezione passata n = 75 sieronegativo n = 22 bambini 0-12 mesi n = 42 VCA IgM VCA IgG VCA IgA EA IgA EA IgG EBNA IgG 96% 90% 75% 65% 90% 0% 0% 100% 96% 76% 93% 100% 1% 89% 47% 0% 10% 100% 5% * 14% * 18% * 0% 0% 0% 2% 36% ** 2% 0% 2% 14% ** quasi 100% positivi variabile positivi quasi 100% negativi Ac materni * il gruppo EBV sieronegativo può comprendere infezioni da EBV molto precoci ed asintomatiche che portano a risultati positivi per VCA IgM, IgA ed IgG ** gli anticorpi materni sono presenti, in concentrazioni molto basse, solo per VCA IgG ed EBNA IgG. Version / 8

8 16.1. Sensibilità e specificità di IBL EBV-ELISA relativamente alle diverse fasi di un infezione da EBV Infezione da EBV acuta: Come si vede nella tabella qui sopra, un infezione acuta da EBV si può identificare chiaramente in base a tre parametri che dovrebbero risultare positivi (VCA IgM, VCA IgG and EA IgG) ed all EBNA IgG, che è risultato chiaramente negativo, come previsto. Infezione EBV riattivata: Diversamente da un infezione acuta, si prevede che un infezione EBV riattivata, associata o meno allo sviluppo di un tumore, sia al 100% negativa per VCA IgM ma chiaramente positiva per VCA IgG, VCA IgA, EA IgG ed EBNA IgG, come da tabella qui sopra. Infezione passata: Le infezioni da EBV passate presentano solo due parametri esplicitamente positivi, il VCA IgG e l EBNA IgG. Tutti gli altri parametri dovrebbero esserequasi negativi conl eccezione del VCA IgA nelle infezioni passate che può persistere fino ad un anno. I pazienti sieronegativi: dovrebbero avere risultati negativi in tutti e sei i parametri. Singoli risultati positivi di VCA IgG, VCA IgA or VCA IgM possono indicare un infezione EBV molto precoce ed ancora asintomatica. Alternativamente, questi risultati positivi isolati sono il segnale di una leggera aspecificità dei dosaggi che, a causa della loro sensibilità particolarmente elevata, possono riconoscere anticorpi di stimolazione policlonale. Per ulteriori chiarimenti si suggerisce di ripetere il test dopo 7-10 giorni. Anticorpi materni: Gli anticorpi materni si rilevano in concentrazioni molto basse solo durante i primi 6-9 mesi di vita e solo i due parametri di infezioni passate, VCA IgG ed EBNA IgG, dovrebbero risultare positivi. Tutti gli altri anticorpi dovrebbero essere negativi, come da tabella di cui sopra. Il fatto che si possano rilevare anticorpi materni dimostra la sensibilità particolarmente elevata degli IBL ELISA relativamente a questi due parametri. Version / 8

9 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Aalto, S. M., Immunoreactivation of Epstein-Barr Virus Due to Cytomegalovirus Primary Infection, Journal of Medical Virology 56: (1998) 2. Bailey, R. E. Diagnosis and treatment of infectious mononucleosis. Am. Fam. Physician 49: (1994) 3. Bauer, G., Epstein-Barr Virus - Bedeutung und Möglichkeiten der Labordiagnostik, Therapeutische Umschau Bd. 51, Heft 8: (1994) 4. Bhaduri-McIntosh, S, Landry, M.L., Nikiforow, S., Rotenberg, M., El-Guindy, A., Miller, G., Serum IgA antibodies to Epstein-Barr virus (EBV) early lytic antigens are present in primary EBV infection. J. Infect. Dis. 195(4): (2007) 5. Cheng, W., et al, Assessing the risk of nosopharyngeal carcinoma on the Basis of EBV antibody spectrum, Int. J. Cancer 97: (2002) 6. Chow K-C., et al, Serum responses to the combination of Epstein-Barr Virus Antigens from both latent and acute phases in nosopharyngeal carcinoma: Complementary test of EBNA-1 with EA-D, Cancer Epidem. Markers & Prevention 6: (1997) 7. Debyser Z., Reynders M., Goubau P., Desmyter J., Comparative evaluation of three ELISA techniques and an indirect immunofluorescence assay for the serological diagnosis of Epstein-Barr virus infection, Clin. Diagn. Virol. 8(19): (1997) 8. Epstein, M. A., Achong., B. G., The EB virus. Annu. Rev. Microbiol. 27: (1973) 9. Fachiroh, J., Schouten,T., Hariwiyanto, B., Paramita, D.K., Harijadi, A., Haryana, S.M., Ng, M.H., Middeldorp, J.M., Molecular diversity of Epstein-Barr virus IgG and IgA antibody responses in nasopharyngeal carcinoma: a comparison of Indonesian, Chinese, and European subjects, J. Infect. Dis. 190(1):53-62 (2004) 10. Gorgievski-Hrisoho, M., et al.: Serodiagnosis of infectious mononucleosis by using recombinant Epstein- Barr virus antigens and enzyme-linked immunosorbent assay technology. J. Clin. Mikrobiol. 28: (1990) 11. Hess, R. D., Routine Epstein-Barr Virus Diagnostics from the Laboratory Perspective: Still Challenging after 35 Years, J. Clin. Microbiol. 42(8), (2004) 12. Linde A.: Diagnosis of Epstein-Barr virus-related diseases. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 100: 83-8 (1996) 13. Obel, N, Hoier-Madsen M., Kongro H., Serological and clinical findings in patients with serological evidence of reactivated Epstein-Barr virus infection. APMIS 104:424 (1996) 14. Prang, N. S., Schwarzmann, F., Aktuelle Perspektiven in der Diagnostik Epstein- Barr Virus assoziierter Erkrankungen, Immun. Infekt.: (1997) 15. Tedeschi, R, Pin, E., Martorelli, D., Bidoli, E., Marus, A., Pratesi, C., Bortolin, M.T., Zanussi S., Vaccher E., Dolcetti R., De Paoli P., Serum antibody response to lytic and latent Epstein-Barr virus antigens in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma patients from an area of nonendemicity, Clin. Vaccine Immunol. 14(4): (2007) Version / 8

10 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: [email protected] WEB: Tel.: +1 (416) Fax: [email protected] WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /