MMP-9. (Matrix Metalloprotease-9) ELISA

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1 Istruzioni per l Uso MMP-9 (Matrix Metalloprotease-9) ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di MMP-9 umana nei sopranatanti delle colture cellulari, nel siero e nel plasma. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 2 4. REAGENTI FORNITI 3 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 4 6. PRELIEVO DEI CAMPIONI 4 7. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 4 8. PRECAUZIONI PER L USO 5 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROCEDURA DEL TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA PERFORMANCE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO (24) 1/18

3 1. USO PREVISTO L ELISA MMP-9 umana è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo della MMP-9 umana. L ELISA MMP-9 umana è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2. SOMMARIO Le metalloproteinasi di matrice (MMP) sono una famiglia di enzimi che operano prevalentemente il rimodellamento di componenti di matrice extracellulare (ECM). L MMP-9, detta anche Gelatinasi B, è il membro più complesso della famiglia in termini di struttura dominante e regolazione della sua attività. L attività dell MMP-9 è sotto severo controllo a vari livelli: trascrizione del gene da parte di citochine e interazioni cellulari; attivazione del pro-enzima da parte di una cascata di enzimi che comprendono serina proteasi ed altri MMP; e la regolazione da parte di inibitori tissutali specifici (TIMPs) o inibitori non specifici. Un ulteriore glicosilazione ha un effetto limitato sull attività in rete della Gelatinasi B e i fattori chemiotattici costituiscono un altro livello di controllo dell attività. La funzione principale delle MMP è la degradazione della funzione fisiologica extracellulare che include la guarigione di ferite, il riassorbimento osseo e l involuzione mammaria. Le MMP contribuiscono anche a condizioni patologiche come artrite reumatoide, malattie delle arterie coronarie e cancro. Si ritiene che promuovano la crescita di queste cellule tumorali una volta metastatizzate. L MMP-9 gioca un ruolo importante nell invasione tumorale, nell angiogenesi e nella metastasi. Nel cancro colon rettale, nella leucemia acuta, nel cancro al seno, nel melanoma umano e nel cancro alla vescica si è rilevato un aumento dei livelli di MMP-9. L MMP-9 potenzia la formazione di metastasi polmonare e l invasione da glioma. A parte la sua funzione nella formazione e diffusione di tumori, l MMP-9, con i suoi effetti distruttivi, è in stretta associazione con patologie polmonari ed asma. Il reclutamento leucocitario MMP-9 nel sistema nervoso centrale significa un coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla. L MMP-9 gioca un ruolo fondamentale nell endocrinologia riproduttiva e presenta un pattern di espressione modificato dopo l infarto del miocardio. 3. PRINCIPIO DEL TEST I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento MMP-9 anti-umana. Figura 1 Micropozzetto Rivestito Anticorpo di Rivestimento La MMP-9 umana presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo anti-umana MMP-9 coniugato, che si lega con la MMP-9 umana catturata dal primo anticorpo. Figura 2 Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato di Biotina (24) 2/18

4 Dopo l incubazione, l anticorpo MMP-9 anti-umana coniugato a biotina non legato viene rimosso durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo MMP-9 anti-umana coniugato a biotina. Figura 3 Seconda Incubazione Streptavidina-HRP - Dopo l incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP Figura 4 Terza Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di MMP-9 umana presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di MMP-9 umana e si determina la concentrazione del campione di MMP-9 umana. Figura 5 Substrato post-reazione 4. REAGENTI FORNITI 1 busta d alluminio con una Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale MMP-9 anti umana 1 flaconcino (70 µl) di Coniugato di Biotina (anticorpo policlonale MMP-9 anti-umana) 1 flaconcino (150 µl) di Streptavidina-HRP 2 flaconcini di Standard di MMP-9 umana liofilizzato, 30 ng/ml se ricostituito 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con l 1 % di Tween 20, 10 % di BSA) 1 bottiglia (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con l 1 % di Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Substrato (Tetrametilbenzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido Fosforico 1M) 4 Film adesivi (24) 3/18

5 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE KIT ELISA Conservare i reagenti del kit ad una temperatura tra 2 C ed 8 C. I reagenti rimanenti, immediatamente dopo l uso, devono essere riposti e conservati al freddo (tra 2 C ed 8 C). La data di scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se i componenti sono conservati in modo corretto e se, in caso di uso ripetuto di un componente, questo reagente non è stato contaminato nel corso delle manipolazioni precedenti. 6. RACCOLTA DEI CAMPIONI ED ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE Con questo dosaggio sono stati testati il sopranatante delle colture cellulari, il siero* ed il plasma (citrato, eparina). Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione, rimuovere il siero dal coagulo non appena possibile. Prestare attenzione a un possibile "Effetto Gancio" a causa di alte concentrazioni di campioni (vedi capitolo 11). I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera evidente, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati a 20 C sotto zero, per evitare la perdita di MMP-9 umana bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. * Prestare attenzione ad un livello possibilmente elevato di MMP-9 umana dovuto al rilascio di MMP-9 da parte delle piastrine durante l attivazione delle piastrine stesse (processo di campionamento). 7. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI - Pipette graduate da 5 e 10 ml - Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta - Micropipette adattabili da 50 µl a 300 µl, multicanale con punte usa e getta - Serbatoio per micropipette multicanale - Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti - Dispositivo per dispensare la soluzione di lavaggio (bottiglia di lavaggio multicanale o sistema di lavaggio automatico) - Lettore di strip per micropozzetti in grado di leggere a 450 nm (620 nm come lunghezza d onda riferimento opzionale) - Acqua distillala in vetro o deionizzata - Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione (24) 4/18

6 8. PRECAUZIONI PER L USO - Tutte le sostanze chimiche sono da considerarsi potenzialmente pericolose. Raccomandiamo quindi che il prodotto venga maneggiato esclusivamente da personale debitamente istruito alle tecniche di laboratorio e che venga usato secondo i principi della buona pratica di laboratorio. Indossare indumenti di protezione idonei, come camici da laboratorio, occhiali e guanti di protezione. Evitare il contatto con la pelle o gli occhi. In caso di contatto con pelle o occhi lavare immediatamente con acqua. Consultare la scheda di sicurezza o dichiarazioni di sicurezza del prodotto per indicazioni più specifiche. - L uso dei reagenti è inteso solo per uso diagnostico in vitro e non dev essere usato per procedure terapeutiche. - Non mescolare o sostituire i reagenti con quelli di altri lotti o di diversa provenienza. - Non usare i reagenti dei kit oltre la data di scadenza indicata sull etichetta. - Durante il magazzinaggio o l incubazione non esporre i reagenti del kit a luce intensa. - Non pipettare con la bocca. - Non mangiare o fumare nelle aree di manipolazione dei reagenti del kit o dei campioni. - Evitare il contatto della pelle o delle membrane mucose con i reagenti del kit o i campioni. - Durante la manipolazione dei reagenti del kit o dei campioni indossare guanti di gomma o di lattice usa e getta. - Evitare il contatto della soluzione di substrato con agenti ossidanti e metalli. - Evitare schizzi o generazione di vapori (aerosol). - Usare punte di pipette e/o pipette usa e getta per evitare la contaminazione microbica o la contaminazione crociata dei reagenti o dei campioni, che potrebbero invalidare il test. - Usare vassoi puliti e adatti a distribuire il coniugato ed il reagente del substrato. - L esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Per la preparazione del reagente deve essere usata acqua distillata in vetro o deionizzata. - Prima dell uso la soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutti i materiali potenzialmente contaminati in quanto potrebbero contenere agenti infettivi. Il metodo migliore per la decontaminazione è l autoclavaggio per minimo un ora a C. - I rifiuti liquidi che non contengono acidi e i rifiuti neutralizzati possono essere mescolati con ipoclorito di sodio in volumi tali che la miscela finale contenga l 1.0 % di ipoclorito di sodio. Per una reale decontaminazione sono necessari 30 minuti. I rifiuti liquidi contenenti acidi devono essere neutralizzati prima dell aggiunta d ipoclorito di sodio (24) 5/18

7 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI I concentrati dei Tamponi di Reagenti devono essere portati a temperatura ambiente e diluiti prima di iniziare la procedura del test. Se si formano cristalli nei Concentrati dei Tamponi, riscaldarli gradualmente al punto che si dissolvano completamente Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare tutto il contenuto (50 ml) della Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare al volume complessivo di 1000 ml con acqua distillata in vetro o acqua deionizzata. Mescolare con cautela per evitare la formazione di schiuma. Trasferire in una bottiglia di lavaggio pulita e conservare a temperatura tra 2 C e 25 C. Tenere in considerazione che il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Lavaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare tutto il contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro pulito e graduato da 100 ml. Portare al volume complessivo di 100 ml con acqua distillata. Mescolare con cautela per evitare la formazione di schiuma. Conservare a una temperatura tra 2 C e 8 C. Tenere in considerazione che la Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Dosaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Preparazione di Coniugato di Biotina Tenere in considerazione che il Coniugato di Biotina deve essere usato entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Coniugato di Biotina con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (24) 6/18

8 9.4. Streptavidina-HRP Tenere in considerazione che la Streptavidina-HRP deve essere usata entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:200 della soluzione concentrata di Streptavidina-HRP con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Stisce Streptavidina-HRP (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard MMP-9 Umana Ricostituire lo Standard MMP-9 Umana aggiungendo acqua distillata. Il volume per ricostituire lo standard è indicato sull etichetta del flaconcino dello standard. Centrifugare o mescolare delicatamente per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea (concentrazione dello standard ricostituito = 30 ng/ml). Far ricostituire lo standard per minuti. Mescolare bene prima di procedere alle diluizioni. Dopo l uso, lo standard rimanente non può essere conservato e deve essere eliminato. Le diluizioni standard si possono preparare direttamente sulla piastra per micropozzetti (vedi 10.d) o, in alternativa, in tubi (vedi 9.5.1) Diluizione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Quindi preparare diluizioni seriali 1:2 per la curva standard come segue: Pipettare 225 µl di Tampone di Dosaggio (1x) in ogni tubo. Pipettare 225 µl di standard ricostituito (concentrazione = 30 ng/ml) nel primo tubo, etichettato come S1, e mescolare (concentrazione dello Standard 1 = 15 ng/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mescolare accuratamente prima del trasferimento seguente. Ripetere le diluizioni seriali altre 5 volte creando così i punti della curva standard (vedi Figura 6). Il Tampone di Dosaggio (1x) serve come bianco. Figura 6 Trasferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 MMP-9 Umana Standard Ricostituito Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) 225 µl Eliminare 225 µl (24) 7/18

9 10. PROTOCOLLO DI TEST a. I campioni prelevati da donatori apparentemente sani non richiedono prediluizione. Per campioni patologici in cui si prevedono alti valori di MMP-9 vanno prediluiti con Tampone di Dosaggio (1x) 1:10-1:25 prima di iniziare il test secondo o schema seguente: Prediluizione 1:10: 25 µl campione µl Tampone di Dosaggio (1x) Prediluizione 1:25: 10 µl campione µl Tampone di Dosaggio (1x) b. Determinare il numero di strip micropozzetti necessario a testare il numero desiderato di campioni, oltre al numero idoneo di pozzetti necessari per eseguire i bianchi e gli standard. Ogni campione, standard, bianco e campione di controllo opzionale dev essere dosato in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non usate e conservarle insieme all essiccante fornito nella bustina metallica, chiusa ermeticamente a una temperatura di 2-8 C. c. Lavare le strip micropozzetti due volte con un Tampone di Lavaggio di circa 400 µl per ogni pozzetto; aspirare completamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l altro. Prima di aspirare, lasciare il tampone di lavaggio all interno dei pozzetti per circa secondi prima dell aspirazione. Fare attenzione a non scalfire la superficie dei pozzetti. Dopo l ultima fase di lavaggio, svuotare i pozzetti e picchiettare le strip micropozzetti su carta assorbente o su una salvietta di carta per rimuovere il Tampone di Lavaggio in eccesso. Usare le strip micropozzetti immediatamente dopo il lavaggio. In alternativa, le strip micropozzetti possono essere collocate capovolte su una carta assorbente bagnata per non oltre15 minuti. Non lasciar asciugare i pozzetti. d. Diluizione standard sulla piastra per micropozzetti (In alternativa, la diluzione standard si può preparare in tubi - vedi 9.5.1): Aggiungere 100 µl Tampone per Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti degli standard. Pipettare 100 µl di standard preparato (vedi Preparazione dello Standard 9.5, concentrazione = 30 ng/ml), in duplicato, nei pozzetti A1 ed A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 aspirando ed espellendo ripetutamente (concentrazione dello standard 1 S1 = 15 ng/ml) e trasferire 100 µl rispettivamente nei pozzetti B1 e B2 (vedi Figura 7). Fare attenzione a non scalfire la superficie interna dei pozzetti. Ripetere la procedura 5 volte creando due serie di diluizioni standard di MMP-9 umana con un range da a 0.23 ng/ml. Eliminare 100 µl del contenuto degli ultimi micropozzetti (G1, G2) usati. Figura 7 Trasferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 MMP-9 Umana Standard Ricostituito Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) 100 µl Eliminare 100 µl (24) 8/18

10 Nel caso di una diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1), pipettare 100 µl di queste diluizioni dello standard (S1 to S7) nei pozzetti dello standard, come da Tavola 1. Tavola 1 La tavola descrive un esempio dell organizzazione dei bianchi, degli standard e dei campioni nelle strip dei micropozzetti A Standard 1 (15.0 ng/ml) Standard 1 (15.0 ng/ml) Campione 1 Campione 1 B Standard 2 (7.5 ng/ml) Standard 2 (7.5 ng/ml) Campione 2 Campione 2 C Standard 3 (3.75 ng/ml) Standard 3 (3.75 ng/ml) Campione 3 Campione 3 D Standard 4 (1.88 ng/ml) Standard 4 (1.88 ng/ml) Campione 4 Campione 4 E Standard 5 (0.94 ng/ml) Standard 5 (0.94 ng/ml) Campione 5 Campione 5 F Standard 6 (0.47 ng/ml) Standard 6 (0.47 ng/ml) Campione 6 Campione 6 G Standard 7 (0.23 pg/ml) Standard 7 (0.23 pg/ml) Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione (24) 9/18

11 e. Aggiungere 100 µl di Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) in duplicato ai pozzetti del bianco. f. Aggiungere 90 µl di Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) ai pozzetti del campione. g. Aggiungere 10 µl di ogni campione in duplicato ai pozzetti del campione. h. Preparare il Conjugato di Biotina (vedi 9.3 Preparazione del Coniugato di Biotina). i. Aggiungere 50 µl Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. j. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. k. Preparare la Streptavidina-HRP (fare riferimento alla preparazione della Streptavidina-HRP 9.4). l. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 4 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. m. Aggiungere 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco. n. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. o Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 4 volte come da punto c. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. p. Pipettare 100 µl di Soluzione di SubstratoTMB in tutti i pozzetti. p. Incubare le strip dei micropozzetti a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 10 minuti. Evitare l esposizione diretta a luce intensa. Lo sviluppo cromatico sulla piastra dev essere monitorato e la reazione del substrato dev essere bloccata (vedi prossimo punto di questo protocollo) prima che i valori dei pozzetti positivi non siano più correttamente registrabili. Il periodo ideale di tempo necessario per lo sviluppo del colore dev essere determinato individualmente per ogni dosaggio. r Si raccomanda di aggiungere la soluzione bloccante quando lo standard più alto ha raggiunto un colore blu scuro. In alternativa, lo sviluppo del colore può essere monitorato con il lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato dev essere bloccata non appena lo Standard 1 ha raggiunto un DO di Bloccare la reazione dell enzima pipettando velocemente 100 µl di Soluzione Bloccante in ogni pozzetto. E importante che la Soluzione Bloccante venga distribuita velocemente ed uniformemente su tutti i pozzetti per inattivare completamente l enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l aggiunta della Soluzione Bloccante, o entro 1 ora se le strip dei micropozzetti sono conservate al buio e ad una temperatura di 2-8 C. s. Leggere l assorbanza di ogni micropozzetto con uno spettrofotometro usando 450 nm. come lunghezza d onda primaria (in alternativa, 620 nm. come lunghezza d onda di riferimento; da 610 nm a 650 nm. il valore è accettabile). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e usando i pozzetti del bianco. Determinare l assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Nota: In caso di incubazione senza aver agitato le sostanze i valori della D.O. ottenuti possono essere inferiori a quelli indicati qui di seguito. Tuttavia i risultati sono ancora validi (24) 10/18

12 11. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di MMP-9 umana sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di MMP-9 circolante umana per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di MMP-9 umana. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione di 1:10 (10 µl di campione + 90 µl Tampone di Dosaggio (1x)), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione finale (a seconda del fattore di prediluizione), ad esempio: Campioni non prediluiti: x 10 Campioni prediluiti 1:10: x 100 Campioni prediluiti 1:25: x Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di MMP-9 umana (Effetto Gancio). Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati della MMP-9 umana, con un Tampone per Dosaggio (1x) in modo da quantificare con precisione i livelli reali di MMP-9 umana. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di MMP-9 umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 8 Curva standard rappresentativa per il MMP-9 umana ELISA. La MMP-9 umana è stata diluita in 2 fasi seriali nel Tampone di Dosaggio (1x). Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio MMP-9 ELISA (ng/ ml) (24) 11/18

13 Tavola 2 Dati tipici relativi all uso del MMP-9 Umana ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione di MMP-9 Umana (ng/ml) D.O. a 450 nm Bianco D.O. Media a 450 nm C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può causare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunte al campione (24) 12/18

14 13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Sensibilità Il limite di rilevamento della MMP-9 umana definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 0.05 ng/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 4 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 7 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di MMP-9 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di MMP-9 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 7.3 %. Tavola 3 La concentrazione media di MMP-9 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione Media MMP-9 Umana (ng/ml) Coefficiente di Variazione (%) (24) 13/18

15 Inter-dosaggio La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 7 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di MMP-9 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di MMP-9 umana ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato è del 10.2 %. Tavola 4 La concentrazione media di MMP-9 umana ed il coefficiente di variazione di ogni campione: Campione Concentrazione Media di Coefficiente di MMP-9 umana (ng/ml) Variazione (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato addizionando 4 livelli di MMP-9 umana al siero. I recuperi sono stati determinati nel corso di 2 esperimenti indipendenti, ognuno con 4 replicati. Il siero non addizionato è stato usato come bianco nel corso di questi esperimenti. Il recupero medio complessivo era del % Parallelismo della Diluizione I campioni di siero con diversi livelli di MMP-9 umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal % al 114 % con un recupero medio complessivo del % (vedi Tavola 5). Tavola 5 Campione 1 2 Diluizione 1:250 1:500 1:1000 1:2000 1:250 1:500 1:1000 1:2000 Concentrazione Attesa di MMP-9 umana (ng/ml) Concentrazione Misurata di MMP-9 umana (ng/ml) Recupero di Concentrazione Attesa (%) (24) 14/18

16 13.5. Stabilità del Campione Stabilità a Congelamento-Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionate o addizionate) sono state conservate a -20 C e scongelate 5 volte e sono stati determinati i livelli di MMP-9 umana. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello MMP-9 umana Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionate o non addizionate) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e dopo 24 ore ne è stato determinato il livello di MMP-9 umana. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dell MMP-9 umana Specificità L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero positivo MMP-9 umana. Non è stata rilevata alcuna cross-reattività Valori Attesi Per la MMP-9 umana sono stati testati campioni di siero e di plasma di donatori apparentemente sani. I livelli di MMP-9 umana rilevati erano compresi tra 2.0 e ng/ml per il siero, tra 9.6 e 87.3 ng/ml per il plasma (citrato) e tra 9.5 e 80.2 ng/ml per il plasma (eparina). Livelli elevati di MMP-9 umana dipendono dal tipo di malattia immunologica. 14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Per informazioni tecniche contattare: Vedi ultima pagina. IBL@IBL-International.com (24) 15/18

17 15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (ml) Coniugato di Biotina Acqua Distillata (ml) Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Streptavidina-HRP Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Fare una diluizione 1:200 di Streptavidina-HRP nella Soluzione Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Standard MMP-9 Umana Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Ricostituire lo standard MMP-9 umana liofilizzato con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) (24) 16/18

18 16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 1. Prediluire i campioni patologici con Tampone di Dosaggio (1x) 1:10-1:25. Campioni provenienti da donatori apparentemente sani non richiedono prediluizione. 2. Determinare il numero di strip di micropozzetti richiesto. 3. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 4. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µl di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 µl da pozzetto a pozzetto. Eliminare 100 µl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 µl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 5. Aggiungere 100 µl di Tamponi di Dosaggio(1x), in duplicato, ai pozzetti del bianco. 6. Aggiungere 90 µl Tampone di Dosaggio (1x) ai pozzetti dei campioni. 7. Aggiungere 10 µl di duplicato ai pozzetti per i campioni designati. 8. Preparare il Coniugato di Biotina. 9. Aggiungere 50 µl di Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. 10. Coprire le strip dei micropozzetti ed incubare per due ore (18-25 C). 11. Preparare la Streptavidina-HRP. 12. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte con il Tampone di Lavaggio. 13. Aggiungere 100 µl di Streptavidina-HRP diluta a tutti i pozzetti. 14. Coprire le strisce di micropozzetti ed incubare per 1 ora a temperatura ambiente (18-25 C). 15. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte con il Tampone di Lavaggio. 16. Aggiungere 100 µl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 17. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 18. Aggiungere 100 µl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 19. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. - Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione 1:10 (10 µl di campione + 90 µl Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)) sulla piastra, la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione finale (a seconda del fattore di prediluizione), ad esempio: Campioni non prediluiti: x 10 Campioni prediluiti 1:10: x 100 Campioni prediluiti 1:25: x (24) 17/18

19 17. Riferimenti Bibliografici Sul Prodotto 1. Atkinson, J. J.; Senior, R. M.. Matrix metalloproteinase-9 in lung remodeling. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 2003; 28: Kelly, E. A.; Jarjour, N. N.. Role of matrix metalloproteinases in asthma. Curr.Opin.Pulm.Med. 2003; 9: Fridman, R.; Toth, M.; Chvyrkova, I.; Meroueh, S. O.; Mobashery, S.. Cell surface association of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B). Cancer Metastasis Rev. 2003; 22: Ohbayashi, H.; Shimokata, K.. Matrix metalloproteinase-9 and airway remodeling in asthma. Curr.Drug Targets.Inflamm.Allergy 2005; 4: Chakraborti, S.; Mandal, M.; Das, S.; Mandal, A.; Chakraborti, T.. Regulation of matrix metalloproteinases: an overview. Mol.Cell Biochem. 2003; 253: John, A.; Tuszynski, G.. The role of matrix metalloproteinases in tumor angiogenesis and tumor metastasis. Pathol.Oncol.Res. 2001; 7: Klein, G.; Vellenga, E.; Fraaije, M. W.; Kamps, W. A.; de Bont, E. S.. The possible role of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in cancer, e.g. acute leukemia. Crit Rev.Oncol.Hematol. 2004; 50: Kanayama, H.. Matrix metalloproteinases and bladder cancer. J.Med.Invest 2001; 48: Van den Steen, P. E.; Dubois, B.; Nelissen, I.; Rudd, P. M.; Dwek, R. A.; Opdenakker, G.. Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Crit Rev.Biochem.Mol.Biol. 2002; 37: Corbel, M.; Boichot, E.; Lagente, V.. Role of gelatinases MMP-2 and MMP-9 in tissue remodeling following acute lung injury. Braz.J.Med.Biol.Res. 2000; 33: Ohbayashi, H.. Matrix metalloproteinases in lung diseases. Curr.Protein Pept.Sci. 2002; 3: Nakada, M.; Okada, Y.; Yamashita, J.. The role of matrix metalloproteinases in glioma invasion. Front Biosci. 2003; 8:e261-e Owen, J. L.; Iragavarapu-Charyulu, V.; Lopez, D. M.. T cell-derived matrix metalloproteinase-9 in breast cancer: friend or foe?. Breast Dis. 2004; 20: Zucker, S.; Vacirca, J.. Role of matrix metalloproteinases (MMPs) in colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 2004; 23: Creemers, E. E.; Cleutjens, J. P.; Smits, J. F.; Daemen, M. J.. Matrix metalloproteinase inhibition after myocardial infarction: a new approach to prevent heart failure?. Circ.Res. 2001; 89: Sellebjerg, F.; Sorensen, T. L.. Chemokines and matrix metalloproteinase-9 in leukocyte recruitment to the central nervous system. Brain Res.Bull. 2003; 61: Shah, B. H.; Catt, K. J.. Matrix metalloproteinases in reproductive endocrinology. Trends Endocrinol.Metab 2004; 15: Thompson, M. M.; Squire, I. B.. Matrix metalloproteinase-9 expression after myocardial infarction: physiological or pathological?. Cardiovasc.Res. 2002; 54: Corbel, M.; Belleguic, C.; Boichot, E.; Lagente, V.. Involvement of gelatinases (MMP-2 and MMP-9) in the development of airway inflammation and pulmonary fibrosis. Cell Biol.Toxicol. 2002; 18: (24) 18/18

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /