Cortisol ELISA RE C. Istruzioni per l Uso

Istruzioni per l Uso Cortisol ELISA Saggio immunoenzimatico per la diagnostica in vitro quantitativa di cortisolo libero nella saliva umana e cortisolo totale nel siero diluito. RE52611 96 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.ibl-international.com

1. USO PREVISTO Saggio immunoenzimatico per la diagnostica in vitro quantitativa di cortisolo libero nella saliva umana e cortisolo totale nel siero diluito come aiuto nella valutazione di Sindrome di Cushing e la Morbo di Addison. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI Il cortisolo (idrocortisone, composto F) è il principale glucocorticoide negli esseri umani ed è prodotto dalla zona fascicolata della corteccia surrenalica. Il 90% del cortisolo circolante è legato alle globuline leganti i corticosteroidi (CBG, Transcortina); il 7% circa all albumina e solo l 1 3% è libero. Solo il cortisolo libero è la parte biologicamente attiva del cortisolo. Il cortisolo libero è rilasciato nella saliva ed escreto per via renale come piccola percentuale dei metabolite del cortisolo. Il livello di cortisolo libero nel sangue regola principalmente la sua secrezione nella corteccia surrenalica con un meccanismo di feedback negativo tramite il CRH (ormone di liberazione della corticotropina) nella regione ipotalamica e l ACTH nella ghiandola pituitaria, ma viene anche influenzato da varie situazioni, principalmente dallo stress. Negli esseri umani vi è una fluttuazione fisiologica di cortisolo che raggiunge il livello massimo di mattina ed il minimo nelle ore notturne (mezzanotte). Questa fluttuazione del livello di cortisolo nel plasma si riflette anche nella saliva, con un picco nei primi 90 minuti dopo il risveglio. La misurazione deel cortisolo è suggerita in caso di patologie che presentano una produzione anormale di glucocorticoidi, come la Sindrome di Cushing e la Morbo di Addison. A causa della fluttuazione diurna dei livelli di cortisolo è necessario prelevare numerosi campioni per valutare un profilo individuale del cortisolo o durante i test dinamici come il test della soppressione da desametasone o il test o il test di stimolazione con ACTH La raccolta di campioni di saliva quindi è un metodo semplice che non comporta lo stress di venipunture ripetute. La misurazione del cortisolo nella saliva è consigliabile in pazienti che presentano livelli di CBG anormali, come donne gravide, soggetti che soffrono di ipotiroidismo, sindrome nefrotica o adiposità accentuata e nel corso di assunzione di diversi farmaci, inclusi i contraccettivi orali. 3. PRINCIPIO DEL TEST Test immunoenzimatico assorbente su fase solida (ELISA) basato sul principio di competizione. Una quantità sconosciuta dell antigene presente nel campione e una quantità fissa di antigene legato all enzima competono per i siti di legame sugli anticorpi che rivestono i pozzetti. Dopo incubazione i pozzetti vengono lavati per bloccare la reazione di competizione. Successivamente alla reazione del substrato l intensità del colore sviluppato è inversamente proporzionale alla quantità dell antigene presente nel campione. I risultati dei campioni possono essere determinati direttamente usando la curva standard. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Il personale delle pulizie dev essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare. Version 2015-01 1 / 10

9. Alcuni reagenti contengono azido di sodio (NaN 3 ) come conservante. In caso di contatto con occhi e pelle risciacquare subito abbondantemente. NaN 3 potrebbe reagire con piombo e rame piombato formando metalli azidici esplosivi. Quando si eliminano i reagenti provvedere a bagnarli con grandi quantità di acqua per evitare formazione di azidi. 10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi. 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso riposta a 2 8 C. 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Saliva Il paziente non dovrebbe bere, mangiare, masticare gomme o lavarsi i denti nei 30 minuti che precedono il prelievo dei campioni. In caso una delle precedenti cose fosse stata fatta far risciascquare la bocca a fondo con acqua fresca 5 minuti prima del prelievo del campione. Non prelevare il campione in caso di infezioni del cavo orale, infiammazioni o lesioni (contaminazione da sangue). La saliva può essere raccolta in un apposito contenitore. Raccogliere un minimo di 0.5 ml di saliva. La salivazione può essere stimolata masticando un pezzo di Parafilm. Si consiglia di congelare il campione prima del test a 20 C. Mescolare e centrifugare Dopo scongelamento centrifugare 10 min a 2000 3000 x g per rimuovere il materiale particolato. Controllare l aspetto della saliva. (Colorazione rosata o rossastra - indice di presenza di sangue) Conservazione: 37 C 18-25 C 2-8 C -20 C (Aliquote) Stabilità: 1 settimana > 2 settimane > 4 settimane 6 mesi Siero Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l integrità del campione di sangue dal momento del prelievo al momento dell esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro interno. Attenzione: Verde Salivette porta a risultati non corretti! Conservazione: 2-8 C -20 C (Aliquote) Stabilità: 48 h 6 mesi Non esporre alla luce solare diretta e al calore. Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento. Version 2015-01 2 / 10

7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x 12x8 MTP 1 x 13 ml ENZCONJ 1 x 3.5 ml 6 x 1.0 ml CAL A-G 2 x 1.0 ml CONTROL 1+2 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP 1 x 100 ml WASHBUF CONC Micropiastra Strisce separabili. Coniugato con anticorpi anti-cortisolo. (coniglio). Coniugato Enzimatico Di Colore Giallo. Pronto/a all uso. Contiene: Cortisolo (purificato cromatograficamente), coniugato a HRP, stabilizzatori. Standard A-G 0; 0.03; 0.06; 0.20; 0.60; 1.50; 4.00 µg/dl 0; 0.3; 0.6; 2.0; 6.0; 15; 40 ng/ml 0; 0.83; 1.7; 5.5; 17; 41; 110 nmol/l Pronto/a all uso. Contiene: Cortisolo, Tampone, 0.1 % BSA, 0.1 % ProClin. Controllo 1+2 Pronto/a all uso. Contiene: Cortisolo, basso e elevato, Tampone, 0.1 % BSA, 0.1 % ProClin. Per le concentrazioni esatte vedere le etichette sulle provette o il certificato di Controllo Qualità. Soluzione Substrato TMB Pronto/a all uso. Contiene: TMB, Tampone, stabilizzatori. Soluzione Stop TMB Pronto/a all uso. 1 M H 2SO 4. 3 x FOIL Pellicola Adesiva Tampone Lavaggio Concentrato (10x) Contiene: tampone fosfato, Tween, stabilizzatori. 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 5; 20; 50; 100; 1000 µl 2. E necessario usare un attrezzatura idonea per la campionatura. 3. Uno standard zero addizionale per la diluizione del siero (si prò ordinare separatamente dall IBL al REF KECO611) I sieri di controllo (p.e. Lyphochek Immunoassay Plus Control, Biorad, Germania) 4. Agitatore orbitale (400-600 rpm) 5. Vortex mixer 6. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti 7. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico 8. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 600-650 nm) 9. Acqua bidistillata o deionizzata 10. Carta assorbente, puntali per pipette e timer Version 2015-01 3 / 10

9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento. 5. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un appropriata distribuzione sulla piastra. 6. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. 7. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti. 8. L umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l involucro finché non ha raggiunto la temperatura ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell involucro con il disseccante. 10. ISTRUZIONI PRE-TEST 10.1. Preparazione di componenti concentrati Diluire / dissolvere Componente Diluente Rapporto Note Conservazione Stabilità 10 ml WASHBUF fino a 100 ml acqua bidist. 1:10 10.2. Diluizione dei Campioni Mescolare energicamente. 2-8 C 4 settimane Campione da diluire con Rapporto Note Saliva non - - - Siero sempre Standard A 1:50 p.e. 5 µl + 245 µl Campioni contenenti concentrazioni più elevate dello standard massimo devono essere diluiti ulteriormente fino ad una proporzione 1:32 con lo standard A e dosati nuovamente. Version 2015-01 4 / 10

11. PROCEDURA DEL TEST 1. Pipettare 50 µl di ogni Standard, Controllo e acilato nei rispettivi pozzetti della micropiastra di provette. 2. Pipettare 100 µl di Coniugato Enzimatico nei ogni pozzetto. Coprire la piastra di estrazione con foglio adesivo. Agitare cautamente. 3. Incubare 2 h a Temperatura Ambiente (18-25 C) in agitatore orbitale (400-600 rpm). 4. Togliere la foglio adesivo. Eliminare incubazione dei campioni. Lavare 4 volte con 250 µl di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una carta assorbente. 5. Pipettare 100 µl di Soluzione Substrato TMB nei ogni pozzetto. 6. Incubare 30 min a Temperatura Ambiente (18-25 C) in agitatore orbitale (400-600 rpm). 7. Arrestare la reazione per aggiungere 100 µl del substrato una soluzione stop TMB nei ogni pozzetto. 8. Misurare la densità ottica con un fotometro a 450 nm (Lunghezza d onda di riferimento: 600-650 nm) entro 15 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop. 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l uso. L utente deve inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi di controllo qualità periodici. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni d incubazione e metodi di lavaggio. Version 2015-01 5 / 10

13. CALCOLO DEI RISULTATI La DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione (asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log. Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile). La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard. A causa della diluizione dei campioni di siero i valori del siero devono essere moltiplicati per un fattore 50. I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati. In caso di campioni diluiti i valori devono essere moltiplicati per il corrispondente fattore di diluizione. Campioni di Saliva con valori eccessivamente elevate devono essere controllati poiché potrebbero avere contaminazione da sangue. Conversione: Cortisolo (ng/ml) x 2.76 = nmol/l Cortisolo (µg/dl) x 27.6 = nmol/l Portata di Riferimento: Saliva: 0.015 4 µg/dl Cortisol Serum: 0.75 200 µg/dl Cortisol Tipica Curva di Calibrazione (Esempio. Non usare per il calcolo!) Standard Cortisolo (µg/dl) OD Media OD/OD max (%) A 0.00 1.699 100 B 0.03 1.401 82 C 0.06 1.278 75 D 0.20 0.905 53 E 0.60 0.524 31 F 1.50 0.304 18 G 4.00 0.155 9 (OD) 1.750 1.500 1.250 1.000 0.750 0.500 0.250 Cortisol ELISA 0.000 0.01 0.10 1.0 10.0 (µg/dl) Standards and Controls are calibrated by use of an isotope dilution-gcms as reference method (Siekmann et al., J Clin Chem Clin Biochem 1982;20:883-892). Version 2015-01 6 / 10

14. VALORI ATTESI I soli risultati non dovrebbero essere l unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici. Soggetti apparentemente sani mostrano i seguenti valori: n µg/dl nmol/l mattina dopopranzo mattina dopopranzo Saliva 340 0.20 1.41 0.04 0.41 5.52 28.92 1.10 11.32 Siero 125 5 25 2 12 138-690 55.2 331.2 Cortisolo (Saliva) Intervallo Tempo seguente il ( / ; > 6 anni; n = 110; 5% - 95% percentile) risveglio (h) Mediano (nmol/l) Intervallo (nmol/l) Mediano (µg/dl) Intervallo (µg/dl) 0 1.5 18.9 5.1-40.2 0.685 0.185 1.457 1.5 3.0 11.8 3.6-28.4 0.428 0.130 1.029 3.0 6.0 6.7 2.1-15.7 0.243 0.076 0.569 6.0 9.0 5.5 1.8-12.1 0.199 0.065 0.438 9.0 15.0 3.3 0.9-9.2 0.120 0.033 0.333 (Westermann J, Demir A, Herbst V. Determination of Cortisol in Saliva and Serum by a Luminescence-Enhanced Enzyme Immunoassay. Clin Lab 2004;50:11-24) Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento. 15. LIMITI DELLA PROCEDURA Livelli infantili non sono ancora stati misurati con questo test. La raccolta e conservazione dei campioni ha influenza significativa sui risultati del test. Vedere la sezione PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI per maggiori dettagli. Per le reazioni crociate vedere la sezione PERFORMANCE. Nota: Campioni contenenti non devono essere usati per il dosaggio. I seguenti componenti del sangue non influenzano significativamente (+/-20% del valore atteso) I risultati del test fino alle concentrazioni indicate di seguito: Saliva Siero Conc. Cortisolo (µg/dl) Conc. Cortisolo (µg/dl) Sangue 0.25 % 0.16; 0.26; 1.09 Emoglobina 1.0 mg/ml 20.4; 15.8 NaN 3 0.25 % 0.18; 0.21; 0.33 Bilirubina 1.0 mg/ml 20.4; 15.8 Trigliceridi 50 mg/ml 20.4; 15.8 Version 2015-01 7 / 10

16. PERFORMANCE Specificità Analitica (Reattività Crociate) Sensibilità Analitica (Limite di Rilevazione) Sensibilità Funzionale Precisione Linearità Intra-Saggio Inter-Saggio Sostanza Reattività Crociate (%) Prednisolone 30 11-Desossi-Cortisolo 7.0 Corticosterone 1.4 Cortisone 4.2 Prednisone 2.5 17α-OH-Progesterone 0.4 Desossi-Corticosterone 0.9 6α-Metil-17α-OH-Progesterone 0.04 0.005 µg/dl Media (Zero-Standard) - 2SD Cross-reattività di altre sostanze esaminate < 0.01 % 0.030 µg/dl Media Conc. < 20 % CV Saliva (n = 20) Siero (n = 20) Conc. SD CV Conc. SD CV (µg/dl) (µg/dl) (%) (µg/dl) (µg/dl) (%) 0.27 0.019 7.3 1.8 0.174 9.9 1.48 0.063 4.2 11.5 0.766 6.7 2.34 0.073 3.1 26.2 1.554 5.9 0.54 0.047 8.8 1.5 0.305 20 1.29 0.120 9.3 11.6 2.006 18 2.35 0.151 6.4 20.3 2.712 13 Saliva Siero Diluizione Misurato Rec. Diluizione Misurato Rec. (µg/dl) (%) (µg/dl) (%) - 0.67 100 1:50 59.2 100 1:2 0.29 85 1:100 30.8 104 1:4 0.16 93 1:200 16.1 109 1:8 0.09 104 1:400 8.6 116 1:16 0.04 93 1:800 4.3 116 1:32 0.02 115 1:1600 1.7 91-0.33 100 1:50 59.3 100 1:2 0.17 104 1:100 29.4 99 1:4 0.08 99 1:200 16.4 111 1:8 0.04 98 1:400 7.5 101 1:16 0.02 107 1:800 4.3 117 1:32 0.01 117 1:50 1.7 94-1.65 100 1:100 70.9 100 1:2 0.83 100 1:200 35.7 101 1:4 0.41 102 1:400 18.5 104 1:8 0.21 113 1:800 10.2 115 1:16 0.10 107 1:1600 5.0 113 1:32 0.05 109 1:3200 2.2 99 Version 2015-01 8 / 10

Recupero Conc. (µg/dl) Saliva 1 (0.13) Saliva 2 (0.16) Saliva 3 (0.15) Saliva Siero Aggiunto Misurato Rec. Conc. Aggiunto Misurato Rec. (µg/dl) (µg/dl) (%) (µg/dl) (µg/dl) (µg/dl) (%) - 0.13 100-10.9 100 0.02 0.16 106 1.5 11.8 95 0.06 0.17 87 Siero 1 3.1 13.8 99 0.20 0.28 86 (10.9) 10.2 19.4 92 0.60 0.61 83 30.6 38.4 92 1.50 1.37 83 76.5 79.9 91-0.16 100-14.0 100 0.02 0.17 97 1.3 14.3 94 0.06 0.20 92 2.6 14.9 90 Siero 2 0.20 0.30 84 8.7 20.5 90 (14.0) 0.60 0.66 87 26.0 33.8 85 1.50 1.53 92 65.0 77.3 98 173.4 191.2 102-0.15 100-19.5 100 0.02 0.16 91 1.5 21.4 102 0.06 0.22 102 Siero 3 3.1 23.9 106 0.20 0.33 94 (19.5) 10.2 28.6 96 0.60 0.74 98 30.6 49.9 100 1.50 1.54 88 76.5 93.0 97 Saliva IBL-ELISA = 1.09 x IBL-Luminescenza IA + 0.01 r = 0.996; n = 82 Confronto del metodo Siero IBL-ELISA = 1.06 x IBL-Luminescenza IA - 1.44 r = 0.987; n = 60 IBL-ELISA = 0.84 x GCMS + 0.36 r = 0.918; n = 33 Version 2015-01 9 / 10

17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1 Determination of Cortisol in Saliva and Serum by a Luminescence-Enhanced Emzyme Immunoassay (IBL Jürgen Westermann, Anke Demir, Victor Herbst). Clin.Lab.50 11-24 (2004) 2 Kirschbaum C. et al. Impact of Gender. Menstrual Cycle Phase and Oral Contraceptives on the Activity of the Hypothalamus-Pituitary-Adrenal Axis. Psychosomatic Medicine 61 154 162 (1999) 3 Raff H.. J. L. Raff and J. W. FindLing. Late-Night Salivary Cortisol as a Screening Test for Cushing s Syndrome. J Clin Endocrinol Metab 83 2681 2686 (1998) 4 Morineau G. et al. Radioimmunoassay of cortisone in serum. urine and saliva to assess the status of the cortisol-cortisone shuttle. Clin Chem 43 1397 1407 (1997) 5 Tunn S. et al. Simultaneous measurement of cortisol in serum and saliva after different forms of cortisol administration. Clin Chem 38 1491 1494 (1992) 6 Shimada M. et al. Determination of salivary cortisol by ELISA and its application to the assessment of the circadian rhythm in children. Hom Res 44 213 217 (1995) 7 Thomopoulos P. et al. Long distance follow up of a patient with intermittent Cushing s disease by use of salivary cortisol measurements. In: Kirschbaum C. et al. (ed.) Assessment of hormones and drugs in saliva in biobehavioral research. 1 st Edition. Hofgrebe & Huber. Seattle (1992) pp 89 92 8 Kahn J. P. et al. Applications of salivary cortisol determinations to psychiatric and stress research: stress responses in students during academic examinations. In: Kirschbaum C. et al. (ed.) Assessment of hormones and drugs in saliva in biobehavioral research. 1 st Edition. Hofgrebe & Huber. Seattle (1992) pp 111 127 9 Laudet M. H. et al. Salivary Cortisol Measurement: A Practical Approach to Assess Pituitary-Adrenal Function. J Clin Endocrinol Metab 66 343 348 (1988) 10 Umeda T. et al. Use of Saliva for Monitoring Unbound Free Cortisol Levels in Serum. Clin Chem Acta 110 245 253 (1981) 11 Peters J. R. et al. Salivary Cortisol Assays for Assessing Pituitary-Adrenal Reserve. Clin Endocrinol 17 583 592 (1982) 12 Buchanan et al. Circadian regulation of cortisol after hippocampal damage in humans; BIOL PSYCHIATRY 2004; 56:651-656 13 Hellhammer et.al Effects of soy lecithin phosphatidic acid and phosphatidylserine complex (PAS) on the endocrine and psychological responses to mental stress; Stress 2004 Vol. 00 (0), pp. 1-8 14 Gaab et al. Psychological determinations of the cortisol stress response: the role of anticipatory cognitive appraisal; Psychoneuroendocrinology 2005 30, 599-610 15 Fries et al. Attenuation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsivity of the Trier social stress test by the benzodiazepine alprazolam; Psychoneuroendocrinology 2006 31, 1278-1288 16 Miller ete al. clinical depression and regulation of the inflammatory response during acute stress; Psychosomatic Medicine 2005 67:679-687 17 Kuhlmann et al. Effects of oral cortisol treatment in healthy young women on memory retrieval of negative and neutral words; Neurobiology of learning and memory 2005 83 158-162 18 Li et al. Life-time socio-economic position and cortisol patterns in mid-life; Psychoneuroendocrinology 2007 32, 824-833 19 Wolf et al. No morning cortisol response in patients with severe global amnesia; Psychoneuroendocrinology 2005 30, 101-105 20 Wessa et al. Altered cortisol awakening response in posttraumatic stres disorder; Psychoneuroendocrinology 2006 31, 209-215 21 Rohleder et al. Sex-specific adaption of endrocrine and inflammatory responses to repeated nauseogenic body rotation; Psychoneuroendocrinology 2006 31, 226-236 22 Rohleder et al. Stress on the dance floor: The cortisol stress response to social-evaluative threat in competitive ballroom dancers; PSPB Vol. 33 No. 1, January 2007 69-84 Version 2015-01 10 / 10

Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) 40 532891-0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com Tel.: +1 (416) 645-1703 Fax: -1704 E-MAIL: Sales@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 / 2012-01-20