CARNITINA libera plasmatica in Fluorimetria - Cod. Z13010 INTRODUZIONE La L-Carnitina (β-hydroxy-γ-trimethylammonium butyrate) è una molecola importante che gioca un ruolo fondamentale nel trasporto di acidi grassi organici a catena lunga attraverso la membrana mitocondriale. Il trattamento terapeutico con L-carnitina è indicato nelle forme di carenza primarie e secondarie. La Acetil-L-Carnitina rappresenta la forma più semplice tra le carnitine eterificate. La L-Carnitina permette il trasporto degli acidi grassi a catena lunga dal citosol cellulare ai mitocondri, ove il processo continua attraverso la β-ossidazione degli acidi grassi, il ciclo di Krebs e la fosforilazione ossidativa fino alla produzione di ATP (AdenosilTrifosfato). I livelli di L-Carnitina libera e della somma dei suoi acil-derivati presenti nel nostro organismo possono essere determinati attraverso il prelevamento di campioni di plasma, urine e tessuti. Il presente metodo consente di analizzare i livelli plasmatici di L-Carnitina base (Free), tramite l ausilio di un derivatizzante specifico e separazione HPLC con lettura in Fluorimetria. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 01547310423 E-mail:info@eurekaone.com www.eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 25 60033 Chiaravalle (AN) ITALY Tel. +39 071 7450790 Fax + 39 071 7496579 Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 008 Carnitina plasmatica in Fluorimetria Febbraio 2010 1
CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del metodo : Il presente metodo consente di determinare la Carnitina libera dopo derivatizzazione e lettura in Fluorimetria. Recupero del Metodo : > 95% Sensibilità del Metodo : circa 0,1 nmol/ml Valori di normalità nel plasma: 0-5 anni 28 38 nmol/ml 6-15 anni 38 48 nmol/ml 15-45 anni 48 56 nmol/ml Contenuto della Confezione : Reagente A Soluzione Deproteinizzante, 1 x 50 ml Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a Temperatura ambiente, tranne lo Starter, le cui modalità di conservazione sono riportate più in basso. Reagente B Soluzione Diluente, 1 x 60 ml Reagente C Soluzione di Condizionamento N 1, 1 x 100 ml Reagente D Soluzione di Condizionamento N 2, 1 x 100 ml Reagente E Soluzione di Condizionamento N 3, 1 x 115 ml Reagente F Soluzione di Lavaggio, 1 x 100 ml Reagente G Soluzione Eluente, 1 x 100 ml Reagente H Soluzione Derivatizzante, 1 x 10 ml Reagente I Soluzione Starter, 11 x 160 mg (fornito a parte in un bauletto con ghiaccio secco) Reagente L Soluzione Tampone, 1 x 20 ml Reagente N Soluzione Test/Std chimico, 1 x 10 ml Reagente M Fase Mobile, 2 x 500 ml CONSERVARE a 20 C. Stabile 5 giorni a 2-8 C. Da ricostituire con 1 ml di Reagente E-Sol.di Condizionamento N 3. Stabile 2 giorni a 20 C una volta ricostituito. Vedere Avvertenze Stoccare a 2-8 C Colonne Clean-up, 100 pz Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da 100 µl Detector fluorimetrico λ ex = 248 nm, λ em = 418 nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore Computer gestionale Modalità di prelievo : Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta con Eparina come anticoagulante. Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Separare il plasma e stoccarlo a 20 C. Stabile 4 settimane. 2
PROCEDURA PREANALITICA : Preparazione della Soluzione Test 100 nmol/ml: Pipettare in una provetta: 900 µl di Acqua grado HPLC 100 µl di Reagente N Sol. Test Questa è la Soluzione Test 100 nmol/ml Dispensare in provette di tipo eppendorf : 100 µl di Soluzione Test 100 nmol/ml appena preparata 500 µl di Reagente A Soluzione Deproteinizzante Deproteinizzare direttamente sul vortex per 10 secondi Dispensare in sequenza in provette di vetro con tappo a vite: 600 µl di Reagente B Soluzione Diluente 200 µl di Calibratore surnatante 100 µl di Reagente H Soluzione Derivatizzante 100 µl di Reagente I Soluzione Starter (dopo ricostituzione) Incubare a 40 C per 30 minuti Diluire 1 a 10 con Acqua di grado HPLC INIEZIONE: Raffreddare Iniettare 100 µl della Soluzione Test preparata nel sistema cromatografico per identificare il tempo di ritenzione della Carnitina che deve essere simile a quello riportato in Fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA : FASE 1 : Preparazione dello Standard chimico e del Campione Diluire il calibratore (o usarlo tal quale) in funzione della concentrazione desiderata per costruire la curva di calibrazione o per ottenere dei controlli. Dispensare in provette tipo eppendorf : 100 µl di Plasma o Calibratore o Controlli 500 µl di Reagente A Soluzione Deproteinizzante Deproteinizzare direttamente sul vortex per 10 secondi Release N 008 Carnitina plasmatica in Fluorimetria Febbraio 2010 3
FASE 2: Derivatizzazione dei Campioni Dispensare in sequenza in provette di vetro con tappo a vite: Standard chimico Campione Reagente B Sol. Diluente 600 µl 600 µl Reagente N Sol. Test/Std chimico surnatante 200 µl Campione surnatante 200 µl Reagente H Sol. Derivatizzante 100 µl 100 µl Reagente I Sol. Starter 100 µl 100 µl Incubare a 40 C per 30 minuti Raffreddare N.B.: il derivatizzato è stabile 3 giorni a 2-8 C FASE 3 : Aggiungere ai campioni 200 µl di Reagente L Soluzione Tampone Al vortex per 10 secondi FASE 4: Condizionamento delle Colonne di Clean-up Pipettare in sequenza nelle Colonne di Clean-up: 1,0 ml di Reagente C Condizionamento N 1 e gettare il liquido percolato. Non portare a secco! 1,0 ml di Reagente D Condizionamento N 2 e gettare il liquido percolato. Non portare a secco! 1,0 ml di Reagente E Condizionamento N 3 e gettare il liquido percolato. Non portare a secco! FASE 5 : Caricare nelle colonne di Clean-up i campioni derivatizzati e diluiti (1200 µl) preparati nella FASE 3 FASE 6: Pipettare nelle colonne di Clean-up 1 ml di Reagente F Soluzione di Lavaggio Gettare il liquido percolato e portare a secco con un leggero flusso d aria! FASE 7: Pipettare nelle colonne di Clean-up 1 ml di Reagente G Soluzione Eluente e portare a secco. Raccogliere l eluato. Al Vortex per 10 secondi FASE 8: Diluire l eluato 1 a 10 con Acqua di grado HPLC. N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 C INIEZIONE: Iniettare 100 µl della soluzione nel Cromatografo e attendere la stampa del cromatogramma. Release N 008 Carnitina plasmatica in Fluorimetria Febbraio 2010 4
REAGENTE N: SOLUZIONE TEST/STANDARD CHIMICO CARNITINA PLASMATICA- Avvertenze Carnitina 1000 nmol/ml PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO 363 VARIAN λ Ex λ Em SENSIBILITA 248 nm 418 nm Medium PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS C18 3 x 150 mm, 5 µm. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Acetonitrile ( 50 : 50 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Acetonitrile ( 50 : 50 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 100 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 100 bar PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z13020 Standard chimico per Carnitina 2 x 5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S29057U Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 100 PZ 5
Carnitina plasmatica in Fluorimetria ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 1 Soluzione test R.T. 9.36 Carnitina 10 nm/ml Fig. 2 Calibratore R.T. 9.27 Carnitina 100 nmol/ml 6
Carnitina plasmatica in Fluorimetria ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 3 Controllo R.T. 9.28 Carnitina 50 nmol/ml Fig. 4 Campione plasmatico R.T. 9.26 Carnitina 81 nmol/ml 7