PROTOPORFIRINA IX libera eritrocitaria e ZincoPROTOPORFIRINA su SANGUE INTERO in FLUORESCENZA Codice Z39010

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Adelmo Verde
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1 PROTOPORFIRINA IX libera eritrocitaria e ZincoPROTOPORFIRINA su SANGUE INTERO in FLUORESCENZA Codice Z INTRODUZIONE La determinazione della ZincoProtoporfirina Eritrocitaria (ZPP-WB) viene usata come test diagnostico per la diagnosi di intossicazione da Piombo. L assorbimento di piombo inibisce l attività dell enzima eme-sintetasi e questo incrementa la concentrazione di Protoporfirina (PP) nel sangue. La Protoporfirina si lega allo Zinco (Zn + ) formando la Zincoprotoporfirina. La Zincoprotoporfirina si forma quindi come metabolita in presenza di concentrazioni elevate di Piombo poiché quest ultimo interferisce con il ruolo della ferrochelatasi nel legame tra Ferro e PP. La concentrazione di ZPP aumenta per intossicazioni da Piombo di durata superiore ai - mesi. Molti ricercatori riportano una correlazione positiva tra la concentrazione di Pb-WB e ZPP-WB quando i lavoratori sono esposti ad alte concentrazioni di Piombo. Per contro, esposizioni a basse concentrazioni di piombo, anche di lunga durata, non sembrano avere effetti sulla concentrazione della ZPP-WB. Molti sono i metodi in uso per la determinazione della ZPP-WB ; il presente metodo permette la determinazione della ZPP-WB con una semplice procedura di estrazione in fase omogenea, senza perciò l uso di solventi organici immiscibili con l acqua, e contemporaneamente isola la ZPP-WB da altre porfirine potenzialmente interferenti. EUREKA srl LAB DIVION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel. + Fax + Release N Giugno

2 CARATTERTICHE DEL KIT Principio del metodo : Il presente metodo determina le concentrazioni di PROTOPORFIRINA IX e ZincoPROTOPORFIRINA su Sangue Intero (WB). A µl di WB viene aggiunto lo Standard Interno ( µl ) e un Reagente di precipitazione ( µl); dopo agitazione al vortex ( sec.) e minuti in microcentrifuga a. rpm, si preleva il surnatante. Dopo agitazione al vortex, µl vengono iniettati nell HPLC Recupero del Metodo : circa - % Sensibilità del Metodo : Linearità del Metodo: Range di normalità in soggetti non esposti: circa, µg/dl > µg/dl - µg/dl - µmol /mol EME - µg/dl Proto IX Riferimento: G Ital Med Lav Erg ;: Suppl Contenuto della Confezione : Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili anni a C. Reagente A - Soluzione Deproteinizzante, x ml Reagente B - Soluzione Standard Interno, x ml Reagente C - Soluzione Test ZincoProtoporfirina, x ml Reagente D - Soluzione Test Protoporfirina IX, x ml Reagente E Calibratore liquido ZincoProtoporfirina, x ml Reagente F - Calibratore liquido Protoporfirina IX, x ml Reagente G - Calibratore liquido ZincoProtoporfirina e Protoporfirina IX, x ml Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Reagente M - Fase Mobile, x ml Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da o µl Detector Fluorimetrico Per enfatizzare la : λ ex = nm, λ em = nm Per enfatizzare la Proto IX: λ ex = nm, λ em = nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore Computer gestionale Modalità di prelievo ematico : Provetta con anticoagulante EDTA o EPARINA Conservazione del Campione: Stabile per circa settimane a C o mesi a C.

3 PROCEDURA PREANALITICA In una provetta da, ml, tipo Eppendorf, pipettare: µl di Reagente C - Sol. Test ZincoProtoporfirina µl di Acqua grado HPLC Si otterrà una Soluzione Test contenente, µg/dl. Oppure pipettare: µl di Reagente D - Sol. Test Protoporfirina IX µl di Acqua grado HPLC Si otterrà una Soluzione Test contenente, µg/dl. INIEZIONE : Iniettare o µl (a seconda del loop adottato) della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia tempi di ritenzione compresi tra e minuti per la ZincoProtoporfirina e compresi tra e minuti per la Protoporfirina IX. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questa Soluzione così ottenuta non deve essere usata come calibratore PROCEDURA ANALITICA FASE : Preparazione dei campioni. Dispensare in provetta di plastica da, ml, tipo Eppendorf: Calibratore Calibratore PP IX Calibratore combinato Campione Reagente E - Calibratore Zincoprotoporfirina µl Reagente F - Calibratore Protoporfirina IX µl Reagente G - Calibratore combinato µl Campione µl Reagente B - Standard Interno µl µl µl µl Reagente A - Sol. Deproteinizzante µl µl µl µl FASE : Centrifugare a. rpm per minuti FASE : Prelevare µl del sovranatante FASE : Aggiungere µl di H O per HPLC Al vortex per secondi Al vortex per secondi INIEZIONE : N.B.: il campione così preparato è stabile giorni a - C Iniettare o µl ( a seconda del Loop adottato ) nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma.

4 PROTOPORFIRINA IX e ZincoPROTOPORFIRINA su SANGUE INTERO - Avvertenze REAGENTE C : SOLUZIONE TEST ZincoPROTOPORFIRINA ZincoPROTOPORFIRINA Circa, µg/dl REAGENTE D : SOLUZIONE TEST PROTOPORFIRINA IX PROTOPORFIRINA IX Circa, µg/dl REAGENTE E : CALIBRATORE LIQUIDO ZincoPROTOPORFIRINA ZincoPROTOPORFIRINA, µg/dl REAGENTE F : CALIBRATORE LIQUIDO PROTOPORFIRINA IX PROTOPORFIRINA IX, µg/dl REAGENTE G : CALIBRATORE LIQUIDO COMBINATO ZincoPROTOPORFIRINA/PROTOPORFIRINA IX ZincoPROTOPORFIRINA PROTOPORFIRINA IX, µg/dl, µg/dl PARAMETRI DEL DETECTOR - VARIAN SPETTROFLUORIMETRO mod. λ DI ECCITAZIONE nm λ DI EMSIONE nm λ DI ECCITAZIONE PROTO IX nm λ DI EMSIONE PROTO IX nm SENSIBILITA' STRUMENTALE - HIGH TEMPO DI INTEGRAZIONE PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENES, x mm, µ, è tassativo l uso della Guard Column Cartridge Holder/CARTUCCIA PRECOLONNA, cod. ZUCC e dei PREFILTRI per CARTUCCIA PRECOLONNA ( x pz.) cod. ZUCC. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENES, mm x mm, µ. Far passare ml di una soluzione di H O : Metanolo ( : v/v ) al flusso di, ml / minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio.condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di, ml / minuto e scaricare i primi ml. Condizionare ulteriormente per minuti anche a ricircolo di fase. Al termine, iniettare il test chimico e verificare la congruità della separazione. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > C si consiglia di conservate a - C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Non necessaria La Fase Mobile della / PP IX è di per sé autopulente. LOOP o µl Flusso di lavoro consigliato, ml / minuto Pressione corrispondente Circa bar PARAMETRI INTEGRATORE HP - / / ATTENUAZIONE PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE

5 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z Standard chimico per Protoporfirina IX e Zincoprotoporfirina x x ml ZFME Colonna Analitica Genesis C ( x,mm - um) PZ ZUCC Guard Column Cartridge Holder, Biocompact PZ ZUCC Prefiltri per colonna C (, mm x cm) x PZ

6 PROTOPORFIRINA IX E ZincoPROTOPORFIRINA IN FLUORESCENZA ( Cromatogrammi di Riferimento ) cal combinatokit.data kit controllo.data Fig. : Calibratore liquido Combinato Fig. : Controllo liquido livello R.T.., µg/dl R.T.., µg/dl R.T.. Proto IX, µg/dl R.T.. Proto IX, µg/dl R.T.. Standard interno R.T.. Standard interno

7 PROTOPORFIRINA IX E ZincoPROTOPORFIRINA IN FLUORESCENZA ( Cromatogrammi di Riferimento ) kit campione.data kit campione.data Fig. : Campione arricchito Fig. : Campione arricchito R.T.., µg/dl R.T.., µg/dl R.T.. PP IX, µg/dl R.T.. PP IX, µg/dl R.T.. Standard Interno R.T.. Standard Interno

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