ETANOLO (ALCOOL ETILICO) URINARIO in UV Codice Z05710

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1 ETANOLO (ALCOOL ETILICO) URINARIO in UV Codice Z05710 BIOCHIMICA E METABOLISMO L alcol etilico è un alcool alifatico di PM=46,07. Di solito viene assunto per via orale ed assorbito rapidamente da stomaco, piccolo intestino e colon. Il tempo necessario per completare il processo di assorbimento varia da 2 a 6 ore, in funzione di fattori quali la presenza di cibo e di altri liquidi, il tempo impiegato per l ingestione della bevanda, la variabilità biologica fra individui. L alcol, vista la solubilità in acqua ed il basso peso molecolare, appena assorbito si distribuisce rapidamente in tutti i tessuti e fluidi del corpo, superando anche la barriera encefalica e quella placentare. L andamento della concentrazione di alcol in alcuni liquidi biologici è stato determinato sperimentalmente da vari autori, anche recentemente (Fig. 1). I risultati mostrano che la massima concentrazione plasmatica viene raggiunta dopo circa 20 minuti dall assunzione e che saliva ed espirato seguono da vicino le variazioni dell alcolemia, mentre nelle urine si raggiunge la massima concentrazione dopo circa due ore dall assunzione. Fig. 1. Alcol etilico: concentrazione nei liquidi biologici Dopo l assorbimento, l Etanolo viene prevalentemente metabolizzato (90-98 %) per via ossidativa, ad una velocità direttamente proporzionale al peso corporeo e costante nel tempo. La prima reazione di ossidazione avviene nel fegato, per azione dell enzima Alcol Deidrogenasi con NAD come coenzima ed accettore di Idrogeno con produzione di Acetaldeide; questa viene successivamente ossidata ad Acido acetico, per azione dell enzima Aldeide Deidrogenasi. La cinetica di eliminazione non ha un andamento esponenziale, come la maggior parte delle sostanze esogene, ma pseudolineare; dopo il completamento della fase di assorbimento e distribuzione, quando la concentrazione raggiunge il valore massimo C 0, la relazione fra concentrazione ematica C t e tempo t, è data dall equazione: C t = C 0 - kt, con k compresa fra 10 e 25 mg/dl/h (Fig.2). Fig.2. Urine ed aria espirata rappresentano anche le principali vie di eliminazione dell alcol e dei suoi prodotti di ossidazione. La cinetica d eliminazione, complessivamente regolata dall equazione di Michaelis Menten, assume tuttavia un andamento pseudolineare dopo il completamento della fase di assorbimento e distribuzione. 1

2 L escrezione di alcol non modificato, di solito, interessa il 2% della quantità assunta ed avviene prevalentemente attraverso reni e polmoni, anche se piccole quantità si ritrovano anche nella saliva ed in altri liquidi organici; può salire fino al 10 % in caso di ingestione massiva. La concentrazione urinaria è di poco superiore a quella ematica; quella alveolare è circa lo 0,05%. La concentrazione in plasma è superiore a quella su sangue intero di circa il 10%. ABUSO CRONICO L assunzione eccessiva di alcol provoca, in tempi rapidi, situazioni cliniche di varia gravità che possono richiedere l intervento del medico del Pronto Soccorso, sia per gli effetti diretti dell ebbrezza che per quelli indiretti (incidenti stradali). Il Laboratorio mette oggi a disposizione del clinico vari esami che, se opportunamente valutati, lo aiuteranno a prendere le decisioni più giuste in relazione a problemi diagnostici e prognostici, quali : 1 - individuare con certezza i forti bevitori; 2 - controllare se un alcolista in terapia si mantiene astemio; 3 - riconoscere le epatopatie di origine alcolica (ALD) dalle altre (NALD); 4 - in corso di epatopatia alcolica, valutare lo stadio della malattia. ALCOLURIA L Etanolo urinario non è un buon indicatore quantitativo per valutare lo stato di ebrezza, data l estrema variabilità della concentrazione, a parità di assunzione. Tuttavia, la maggiore permanenza dell Etanolo nelle urine, rispetto al sangue, lo rende utile per monitorare l astinenza: a questo scopo occorre che l esame venga richiesto quasi giornalmente, a causa del basso tempo di emivita dell etanolo. Rispetto al sangue, le urine hanno il grosso vantaggio di non richiedere prelievi invasivi. La presenza di Etanolo nelle urine va valutata caso per caso. La positività a bassi valori di concentrazione (0,3-0,5 g/l) in urine prelevate dopo pranzo è poco significativa mentre è preoccupante se il prelievo è fatto di mattina. Un solo valore positivo non significa nulla mentre più valori positivi indicano evidentemente l assunzione cronica di alcol. Valori positivi in persone che dovrebbero essere astinenti sono ovviamente indice di interruzione dello stato di sobrietà. L Etanolo, come visto, persiste in circolo per circa 6 ore e si ritrova nelle urine fino a 12 ore dopo l assunzione. Per assunzioni precedenti tale intervallo, in letteratura sono riportati altri marcatori che persistono nelle urine fino a 24 ore. CHIMICA E DOSAGGIO MEDIANTE TECNICA HPLC Il presente metodo determina le concentrazioni urinarie dell Etanolo derivatizzandolo e leggendolo in HPLC a λ=385 nm. E necessario congelare il campione urinario appena prelevato a -20 C EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 005 Etanolo urinario in UV Febbraio

3 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: L Etanolo viene trattato a 40 C per 30 minuti. Dopo raffreddamento, viene aggiunto il derivatizzante e la soluzione viene posta a 70 C per 15 minuti. Dopo raffreddamento la soluzione viene iniettata direttamente in HPLC. Recupero del Metodo : 100% Sensibilità del Metodo : < 0,02 g/l Range dinamico del metodo : 0,02-3,16 g/l Valori di riferimento: n.d. (Rif.Il laboratorio nell intossicazione acuta e nell abuso cronico di alcol. Badii, Corezzi, Tavanti) Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Reagente A - Soluzione Tampone 1, 1 x 20 ml Reagente B Reagente B, 1 x 5 ml Reagente C - Soluzione Tampone 2, 1 x 10 ml Reagente D - Soluzione Derivatizzante, 1 x 10 ml Reagente E - Soluzione Stabilizzante, 1 x 10 ml Reagente F - Soluzione Test/Std Chimico, 1 x 10 ml Vedi Avvertenze Reagente G - Soluzione Diluente, 1 x 100 ml Reagente M - Fase mobile, 3 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 o 100 µl. Detector spettrofotometrico UV/VIS λ=385 nm Registratore di cromatogrammi Autocampionatore Computer e software gestionale Modalità per il prelievo urinario : Raccogliere 10 ml di urine in una provetta idonea e congelare a - 20 C. Stabile 4 mesi a -20 C. 3

4 PROCEDURA PREANALITICA Diluizione 1:20 della Soluzione Test 3,16 g/l In una provetta di vetro con tappo in teflon pipettare : 950 µl di H 2 O di grado HPLC 50 µl di Reagente F Soluzione Test In una provetta di vetro con tappo in teflon pipettare nell ordine: 200 µl di Reagente A - Sol. Tampone 1 50 µl di Reagente B 50 µl di Sol. Test diluita Incubare a 40 C per 30 minuti Aggiungere nell ordine: 100 µl di Reagente C Sol. Tampone µl di Reagente E Sol. Stabilizzante 100 µl di Reagente D Sol. Derivatizzante Al vortex per 10 secondi Raffreddare Incubare a 70 C per 15 minuti Al vortex per 10 secondi INIEZIONE : Raffreddare e agitare al vortex per 10 secondi Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Diluizione dei Campioni, dello standard chimico di calibrazione e degli eventuali Controlli Verificare e portare il ph del campione urinario a 7,5. Campione Standard chimico di Controllo calibrazione Reagente G- Sol. Diluente 950 µl 950 µl 950 µl Campione 50 µl Reagente F Std chimico di 50 µl calibrazione Controllo 50 µl IMPORTANTE : La soluzione standard chimico di calibrazione va preparata di volta in volta Release N 005 Etanolo urinario in UV Febbraio

5 FASE 2 : Preparazione dei Campioni, dello standard chimico di calibrazione e dei Controlli Dispensare in provette di vetro con tappo a vite in teflon: Bianco Campione Standard Controllo chimico di calibrazione Reagente A - Sol. Tampone µl 200 µl 200 µl 200 µl Reagente B 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Acqua di grado HPLC 50 µl Campione 50 µl Standard chimico di calibrazione 50 µl Controllo 50 µl Al vortex per 10 secondi FASE 3 : Porre la serie di provette a 40 C per 30 minuti Lasciar raffreddare a temperatura ambiente e agitare al vortex per 10 secondi FASE 4 : Procedura di derivatizzazione Aggiungere nell ordine: 100 µl di Reagente C Sol. Tampone µl di Reagente E Sol. Stabilizzante 100 µl di Reagente D Sol. Derivatizzante Al vortex per 10 secondi FASE 5 : Porre la serie di provette in stufa a 70 C per 15 minuti Lasciar raffreddare a temperatura ambiente e agitare al vortex per 10 secondi N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Release N 005 Etanolo urinario in UV Febbraio

6 ETANOLO URINARIO - Avvertenze REAGENTE F : STANDARD CHIMICO / SOLUZIONE TEST Etanolo 3,16 g/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 385 nm 0,001 AUFS 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ), è tassativo l uso del Metaguard Guard Column, cod. ZA600MG (1 x 3 pz) e del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS C 18 (4,6 x 150 mm, 4 µ). Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 50 µl o 100 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 80 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 7 o 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z05720 Standard chimico per Etanolo urinario 2 x 5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ ZA600MG Metaguard Guard Column 1 x 3 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ 6

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8 ETANOLO URINARIO IN UV (Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 3 : Soluzione Test Fig. 4 : Campione di urina di soggetto sobrio R.T Etanolo 3,16 g/l 8

9 ETANOLO URINARIO IN UV (Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 5 : Campione di urina di medio bevitore Fig. 6 : Campione di urina di forte bevitore R.T Etanolo 0,79 g/l R.T Etanolo 3,16 g/l 9