IDROSSIPROLINA URINARIA in UV Codice Z01010

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1 IDROSSIPROLINA URINARIA in UV Codice Z Caratteristiche chimiche L Idrossiprolina o (s,s)--hydroxy-l-pyrrolidine--carboxylic acid, è un aminoacido secondario con un idrossile in posizione sull anello pirrolidinico, di PM=,. Biochimica L Idrossiprolina è contenuta quasi esclusivamente nel collagene, dove rappresenta circa il % degli aminoacidi e proviene dalla idrossilazione della prolina. Il collagene, principale componente della sostanza ossea, è una proteina la cui struttura primaria è costituita da una sequenza ripetitiva di glicina, prolina, idrossiprolina e idrossilisina. Poiché circa la metà del collagene totale risiede nel tessuto osseo, un riassorbimento osseo causa un impoverimento di collagene e la liberazione di quantità di Idrossiprolina tanto maggiori quanto maggiore sarà la distruzione del collagene stesso. Infatti, a causa dei fenomeni di riassorbimento osseo, l idrossiprolina non viene più riutilizzata ed aumenta la sua escrezione urinaria. Essa subisce dapprima una filtrazione a livello del glomerulo renale e successivamente un riassorbimento, per il %, a livello dei tubuli; il % rimanente subisce una eliminazione renale. Per tali ragioni il suo dosaggio urinario è utilizzato come marker di aumentato riassorbimento osseo (per es. osteoporosi postmenopausa, morbo di Paget, neoplasie con lesioni ossee, osteomalacia, ustioni, ipertiroidismo, osteomielite acuta). Esistono numerosi studi sull osteoporosi che correlano le concentrazioni dell idrossiprolina urinaria con misure dirette del riassorbimento osseo (es. Densitometria ossea, cinetica del calcio ); nell osteoporosi post-menopausa si evidenzia che più del % delle pazienti hanno valori elevati di idrossiprolina. Si può quindi concludere che l Idrossiprolina urinaria è un importante marker di riassorbimento osseo. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 7 info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva /7/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N Idrossiprolina urinaria in UV Agosto

2 CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del Metodo: L idrossiprolina, dopo idrolisi acida a C per ore, viene derivatizzata e iniettata nell HPLC. Recupero del Metodo : % Sensibilità del Metodo : Range dinamico del metodo : Range di normalità nelle urine delle h : Contenuto della confezione : Reagente A Soluzione Alcalina, x ml, mg/l, mg/l,, mg/ h Tutti i reagenti sono pronti all'uso, eccetto il Reagente D che va ricostituito, e stabili anni a C. Reagente B Soluzione Tampone, x ml Reagente C Soluzione Standard Interno, x ml Reagente D Soluzione Derivatizzante, x, ml Reagente E Soluzione Derivatizzante, x ml Da ricostituire con ml di Acetonitrile (non fornito nel kit) Reagente H Soluzione Test, x ml Reagente I Calibratore liofilo, x ml Vedi Avvertenze Reagente W Sol. Acidificante, x ml Reagente M Fase Mobile, x ml Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da µl Detector Spettrofotometrico λ = nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore Computer gestionale Modalità di raccolta delle Urine delle h : Prima di iniziare la raccolta versare nel recipiente circa ml di HCl M per ogni litro di Urina che presumibilmente verrà emessa. Per la raccolta di una persona adulta occorreranno circa ml. Per la raccolta di un bambino occorreranno circa ml. Un campione di circa ml di urina delle h va prelevato ed inviato al Laboratorio con l'indicazione della diuresi totale. Congelare il campione a C se l analisi deve essere differita. Stabile oltre mesi. AVVERTENZE PER LA RACCOLTA : I pazienti dovranno seguire un regime dietetico, almeno nelle h che precedono la raccolta delle urine delle h, escludendo alimenti che contengono collagene (carne e suoi derivati, pesce, dolci e prodotti contenenti gelatina).

3 PROCEDURA PREANALITICA Prima di procedere all analisi è consigliabile effettuare una prova di verifica del sistema analitico mediante l analisi della Soluzione Test, omettendo di aggiungere lo Standard Interno. Seguire la seguente procedura : Pipettare in provetta conica di PP con tappo da, ml : µl di Reagente B Sol. Tampone µl di Reagente H Sol. Test µl di Reagente E Sol. Derivatizzante (verificare che il ph sia ±.) Chiudere la provetta conica, al Vortex per secondi Incubare a Temperatura Ambiente per minuti INIEZIONE : Iniettare µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig.. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. La soluzione così preparata può essere riutilizzata come Test per le successive sedute analitiche, purchè si abbia l accortezza di aliquotarla e stoccarla in congelatore a C ( stabile circa mese ). Release N Idrossiprolina urinaria in UV Agosto

4 PROCEDURA ANALITICA FASE : Preparazione dei campioni Idrolisi acida dei campioni : Pipettare in una provetta di vetro idonea con tappo a vite e setto in teflon a tenuta, µl di Calibratore o Controllo o Campione di urina e aggiungere µl di HCl N o 7% ( non fornito nel kit ) Chiudere le provette e porle a C per h FASE : Preparazione dei campioni per la derivatizzazione Togliere i campioni dalla stufa e raffreddarli. L idrolizzato può essere ali quotato e conservato a C. Stabile circa mese. Trasferire in provetta di plastica da ml in sequenza : µl di Idrolizzato µl di Reagente A Soluzione Alcalina Attenzione : Sviluppo di bollicine di CO µl di KOH concentrato % (non fornito nel kit) µl di Reagente B Soluzione Tampone µl di Reagente C Standard Interno FASE : Derivatizzazione Trasferire in vials di vetro da, ml con tappo a vite: Al vortex per secondi Controllare che il ph della soluzione abbia un valore di circa, µl della soluzione precedentemente preparata µl di Reagente D Soluzione Derivatizzante (dopo ricostituzione del flacone con ml di Acetonitrile) Al Vortex per secondi Incubare a Temperatura Ambiente per minuti Aggiungere : µl di Reagente E Soluzione Derivatizzante Chiudere la provetta conica, al Vortex per secondi Incubare a Temperatura Ambiente per minuti Al termine aggiungere: µl di Reagente W Soluzione Acidificante Al vortex per secondi FASE : Centrifugare a. rpm per minuti La soluzione così ottenuta è stabile oltre h se tenuta in provetta chiusa, possibilmente al riparo dalla luce, a C INIEZIONE : Iniettare µl del sovranatante nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Release N Idrossiprolina urinaria in UV Agosto

5 REAGENTE H : SOLUZIONE TEST IDROSSIPROLINA URINARIA in UV Avvertenze IDROSSIPROLINA Circa mg/l REAGENTE I : CALIBRATORE URINARIO LIOFILO Lot. IDROSSIPROLINA Modalità d uso: il Calibratore deve essere usato per calibrare il sistema HPLC. Deve essere preparato come un urina campione. Ricostituzione: aggiungere esattamente ml di H O di grado HPLC, rimettere il tappo e mescolare per inversione. Lasciare riposare per - min. Conservazione e stabilità: sottoforma di liofilo il calibratore è stabile mesi dalla data di preparazione se conservato a - C. Dopo la ricostituzione la stabilità è di ore a temperatura ambiente, 7 giorni a - C e mese a C. Agitare sempre prima dell uso. Confezionamento : x ml Precauzioni : l urina umana usata per la costruzione di questo calibratore va considerata come potenzialmente infetta e trattata con cura., mg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTOFOTOMETRICO VARIAN λ nm GAIN Low o Medium TEMPO DI INTEGRAZIONE o PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS, x mm, µ, è tassativo l uso del Metasaver Precolumn Filter. um ( x pz.) cod. ZA. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS, x mm, µ. Disconnettere il detector e far passare ml di una soluzione di H O : Metanolo o Acetonitrile ( : v/v ) e successivamente ml di H O per HPLC, al flusso di, ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di, ml/minuto e scaricare i primi ml. Condizionare ulteriormente per minuti anche a ricircolo di fase. Per l analisi dell Idrossiprolina NON è consigliato lavorare a ricircolo di fase. Se la temperatura amb. del Laboratorio è > C si consiglia di conservare a - C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare ml di H O e scaricare. Flussare una soluzione di H O : Metanolo o Acetonitrile ( : v/v ) per minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare ml di H O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP µl Flusso di lavoro consigliato, ml/minuto Pressione corrispondente Circa bar PARAMETRI INTEGRATORE HP / / ATTENUAZIONE o 7 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE

6 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z Calibratore liofilo in urina per Idrossiprolina x ml Z7 Controllo liofilo in urina per Amine Biogeniche, Livello x ml Z Controllo liofilo in urina per Amine Biogeniche, Livello x ml Z Controllo liofilo in urina per Amine Biogeniche, Livelli e x x ml ZFME Colonna Analitica Genesis C ( x,mm - u) PZ ZA Metasaver Precolumn Filter. um x PZ S7U Vial di vetro a volume ridotto da, ml a ul + tappini x PZ

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8 IDROSSIPROLINA URINARIA IN UV ( Cromatogrammi di Riferimento ) mv TEST.DATA [MIB - Channel ] mv CAL.DATA OH-prolina Std Int 7 RT [min] 7-7 RT [min] 7 Fig. : Soluzione Test R.T.. Idrossiprolina Fig. : Calibratore liofilo urinario R.T.. Idrossiprolina mg/l R.T.. Standard Interno

9 IDROSSIPROLINA URINARIA IN UV ( Cromatogrammi di Riferimento ) mv C.DATA mv C+.DATA 7 7 OH-prolina 7 Std Int 7 Std Int OH-prolina - RT [min] - RT [min] Fig. : Controllo liofilo urinario livello R.T.. Idrossiprolina mg/l R.T.. Standard Interno Fig. : Campione urinario non patologico R.T.. Idrossiprolina R.T.. Standard Interno