1 IDROSSIPIRENE URINARIO in FLUORIMETRIA Codice Z38010
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1 1 IDROSSIPIRENE URINARIO in FLUORIMETRIA Codice Z38010 BIOCHIMICA 1-HYDROXYPYRENE (1-OH-Pyr) è un prodotto del metabolismo del PYRENE, componente della famiglia degli Idrocarburi Policiclici aromatici (IPA). Il termine generico IPA rappresenta più di 200 composti di condensazione, a molti dei quali vengono riconosciute elevate capacità carcinogene e mutagene. L International Agency for Research on Cancer (IARC) ha classificato il benzo(a)pyrene, il benzo(a)antracene e il dibenzo(a,h)antracene come sostanze di gruppo 2A (probabile carcinogeno umano). Il Pyrene è un idrocarburo che si ritrova sia sotto forma di vapore che di particolato e può quindi essere assorbito sia per via respiratoria che per via cutanea. Inoltre è sempre presente in quantità rilevanti nelle miscele di IPA. Questa ed altre ragioni hanno fatto si che sia stato scelto da molti ricercatori come tracciante dell inquinamento da IPA insieme al suo metabolita 1- Hydroxypyrene. L 1 Hydroxypyrene viene escreto nelle urine coniugato con l acido glucuronico e con il solfato; per liberarlo e renderlo disponibile all analisi occorre quindi idrolizzare il campione con la β-glucuronidasi/arilsulfatasi per 16 h a 37 C a ph=5,0. L escrezione urinaria dell 1-OH-Pyr viene assunta come possibile biomarker di esposizione al Pyrene e agli IPA. Fig. 1 : Metabolismo dell 1 Idrossipirene EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N Idrossipirene urinario in Fluorimetria Marzo
2 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: L 1-IDROSSIPIRENE, dopo idrolisi enzimatica a ph=5,0 viene purificato su colonna di clean-up e l eluato viene iniettato nel sistema HPLC. Recupero del Metodo : 100% Sensibilità del Metodo : Valori accettabili in soggetti non esposti : Valori di riferimento : Range dinamico del metodo : 50 ng/l < ng/g creatinina Riferimento: G Ital Med Lav Erg 2003;25:1 < ng/g creatinina ng/l Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a Temperatura Ambiente ( 20 C ). Il Calibratore è stabile 36 mesi a 2 8 C. Reagente A Soluzione Tampone x Idrolisi, 1 x 110 ml Reagente B Enzima di Idrolisi, 1 x 1,0 ml Da ricostituire con 9,0 ml di Reagente A. Quando ricostituito, l enzima è stabile 1 anno a 2 8 C. Reagente C Soluzione di Condizionamento 1, 1 x 100 ml Reagente D Soluzione di Condizionamento 2, 1 x 100 ml Reagente E Soluzione di Lavaggio 1, 2 x 150 ml Reagente F Soluzione di Lavaggio 2, 1 x 40 ml Reagente G Soluzione Eluente, 1 x 50 ml Reagente H Soluzione Test, 1 x 5 ml Reagente I Soluzione Standard Interno, 1 x 5 ml Reagente L Calibratore Liofilo, 2 x 10 ml ( Vedi Avvertenze ) Reagente M Fase Mobile, 2 x 500 ml Colonne di clean-up, 100 pz Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 µl Detector Fluorimetrico λ Ex = 242 nm λ Em = 388 nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore Computer gestionale Modalità per il prelievo : Fase preanalitica : Urine inizio turno oppure Urine fine turno oppure Urine fine settimana e fine turno. Non occorre alcun conservante Far pervenire al Laboratorio una provetta con 10 ml di campione Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Se non si analizza subito, stoccare il campione in frigorifero. Stabile 2 settimane a 2 8 C. Stabile circa 2 mesi a 20 C. 2
3 PROCEDURA PREANALITICA In una provetta pipettare : 900 µl di H 2 O di grado HPLC 100 µl di Reagente H - Soluzione Test NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 50 µl di questa soluzione in HPLC per identificare il tempo di ritenzione dell 1-Idrossipirene che deve essere simile a quello riportato in fig.2. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Idrolisi dei campioni In provette di plastica da 10 ml idonee dispensare in sequenza. Calibratore Campione Reagente A Soluzione Tampone 1,0 ml 1,0 ml Reagente L Calibratore Liofilo 2,0 ml Campione 2,0 ml Reagente B Enzima di idrolisi (ricostituito) 50 µl 50 µl Controllare che il ph sia 5,0 Eventualmente correggerlo FASE 2 : Condizionamento delle colonne di clean-up: Al vortex per 20 secondi Porre in stufa a 37 C per 16 ore Versare nelle colonne di clean-up 1,0 ml di Reagente C Sol.di Condizionamento 1 Scartare l eluato Versare nelle colonne di clean-up 1,0 ml di Reagente D Sol. di Condizionamento 2 Scartare l eluato FASE 3 : Caricamento dei Campioni, Calibratore e Controlli nelle rispettive colonne di clean-up: Aggiungere ad ogni campione idrolizzato 50 µl di Reagente I Soluzione Standard interno Versare 2,5 ml di campione nella colonna di clean-up Scartare l eluato. FASE 4 : Lavaggio delle colonne di clean-up: Versare nelle colonne 3,0 ml di Reagente E Sol. di Lavaggio 1 Scartare l eluato Versare nelle colonne 0,4 ml di Reagente F Sol. di Lavaggio 2 Scartare l eluato FASE 5 : Eluizione: Eluire con 500 µl di Reagente G Soluzione Eluente Raccogliere l eluato Aggiungere all eluato 500 µl di Acqua di grado HPLC INIEZIONE : Al vortex per 10 secondi N.B.: il campione così preparato è stabile 7 giorni a 2-8 C Iniettare 50 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma Release N Idrossipirene urinario in Fluorimetria Marzo
4 1-IDROSSIPIRENE - Avvertenze REAGENTE H : SOLUZIONE TEST 1 IDROSSIPIRENE circa ng/l Fattori di conversione: 1,0 µmoli = 218,25 µg di Idrossipirene / 1,0 mg = 4,58 µmoli di Idrossipirene REAGENTE L : CALIBRATORE URINARIO LIOFILO Lotto n ZUR IDROSSIPIRENE ng/l Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. Aggiungere esattamente 10 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 15 minuti fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Conservazione e stabilità : i Calibratori liofili sono stabili 36 mesi dalla data di preparazione se conservati a 2 8 C. Una volta ricostituiti almeno 12 ore a temperatura ambiente, 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 20 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 2 x 10 ml Precauzioni : questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO λ Ex 242 nm λ Em 388 nm GAIN 1 X 100 TEMPO DI INTEGRAZIONE 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metaguard - Guard Column (1 x 3 pz), cod. ZA600MG e del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. Al termine, iniettare il test chimico e verificare la congruità della separazione. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di ( 80:20 v/v) Acetonitrile:Acqua per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 50 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 90 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 7 o 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE 4
5 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z9969 Calibratore multiparametrico per metaboliti di composti tossici organici 5 x 10 ml Z8867 Controllo multiparametrico per metaboliti di composti tossici organici-livello 1 10 x 10 ml Z8868 Controllo multiparametrico per metaboliti di composti tossici organici-livello 2 10 x 10 ml Z8869 Controllo multiparametrico per metaboliti di composti tossici organici_livelli 1 e 2 2 x 10 x 10 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ S Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ ZITC4000V1 Vial di vetro a volume ridotto da 1,5 ml a 15 ul 1 x 100 PZ ZITC400054B Tappi neri per vial di vetro a volume ridotto 1 x 100 PZ 5
6 1 IDROSSIPIRENE ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 2 Soluzione Test Fig. 3 Campione di urina arricchito Fig. 4 Campione di urina arricchito R.T Standard Interno R.T Standard Interno R.T Standard Interno R.T OH-PYR ng/l R.T OH-PYR 500 ng/l R.T OH-PYR ng/l Attenzione: i cromatogrammi degli Standard di Calibrazione hanno valori di concentrazione diversi da quelli riportati nelle Avvertenze 6
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