OPPIACEI urinari in Fluorimetria Cod. Z45010 (Morfina, Codeina, Diidrocodeina e 6-Monoacetilmorfina) Metodo di conferma in HPLC

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1 OPPICEI urinari in Fluorimetria Cod. Z (orfina, Codeina, Diidrocodeina e 6-onoacetilmorfina) etodo di conferma in HPLC ITRODUZIOE Gli Oppiacei sono alcaloidi con una lunga storia di uso ed abuso. La loro determinazione di screening nei liquidi biologici (soprattutto in urina) viene generalmente effettuata usando tecniche immunometriche con l ausilio di anticorpi monoclonali e successiva marcatura con vari reagenti. Poiché tali tecniche non possono escludere falsi positivi, le positività allo screening devono essere confermate con tecnica alternativa, generalmente con tecnica cromatografica sia Gassosa (GC) che Liquida (LC) entrambe accoppiate con detector specifici e selettivi (UV, Fluorescenza, S). Il presente metodo consente di determinare la orfina, la Codeina, la 6-onoacetilmorfina e la Diidrocodeina urinari previa estrazione SPE e lettura in Fluorimetria EUREK srl LB DIVISIO VT 7 info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 6 Chiaravalle () ITLY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release 7 Oppiacei urinari in Fluorimetria Settembre

2 Principio del metodo : CRTTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare la orfina (il maggiore metabolita dell Eroina), la Diidrocodeina, la Codeina e la 6-onoacetilmorfina urinarie previa estrazione SPE e lettura in Fluorimetria. Recupero del etodo : 9 % Sensibilità del etodo : orfina, ng/ml Diidrocodeina, ng/ml Codeina, ng/ml 6-8, ng/ml Valore di cut-off: orfina ng/ml Diidrocodeina ng/ml Codeina ng/ml Contenuto della Confezione : 6-onoacetilmorfina ng/ml Rif. Procedure applicative del procedimento n.99/cu ottobre 7 Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili anni a 8 C. Reagente Enzima di idrolisi, x ml Da ricostituire con 9, ml di Reagente B. Quando ricostituito, l enzima è stabile anno a 8 C. Reagente B Soluzione Tampone per idrolisi, x ml Reagente C Soluzione Condizionamento e Lavaggio, x ml Reagente D Soluzione Condizionamento, x ml Reagente E Soluzione Tampone, x ml Reagente F Soluzione Lavaggio, x ml Reagente G Soluzione Lavaggio, x ml Reagente H Soluzione Eluente, x 8 ml Reagente I Soluzione Stabilizzante, x ml Reagente L Soluzione Test orfina, x, ml Reagente L Soluzione Test Diidrocodeina, x, ml Reagente L Soluzione Test 6-, x, ml Reagente L Soluzione Test Codeina, x, ml Reagente liofilo urinario, x ml Reagente liofilo urinario, x ml Reagente liofilo urinario, x ml Reagente liofilo urinario, x ml Reagente liofilo urinario, x ml Reagente P liofilo urinario 6--, x ml Reagente P liofilo urinario 6--, x ml

3 Reagente P liofilo urinario 6--, x ml Reagente P liofilo urinario 6--, x ml Reagente P liofilo urinario 6--, x ml Reagente Fase obile, 8 x ml Colonne di Clean-up, pz Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da µl Detector Fluorimetrico λ EX = nm λ E = nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : utocampionatore Computer gestionale odalità di prelievo urinario : Prelevare ml urina Fase pre-analitica : Stabile per circa mesi a C Release 7 Oppiacei urinari in Fluorimetria Settembre

4 PROCEDUR PRELITIC: In una provetta pipettare : µl di H O di grado HPLC µl di Reagente L Soluzione Test orfina (oppure L o L o L a seconda dell analita che si vuole ricercare) Vortex per sec. Se si vuole invece preparare un Test ix: 8 µl di H O di grado HPLC µl di Reagente L Soluzione Test orfina µl di Reagente L Soluzione Test Diidrocodeina µl di Reagente L Soluzione Test 6-onoacetilmorfina µl di Reagente L Soluzione Test Codeina IIEZIOE : Vortex per sec. Iniettare µl nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. OT : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare µl di questa soluzione sul sistema cromatografico per identificare il tempo di ritenzione della orfina che deve essere simile a quello riportato in fig.. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDUR LITIC: FSE : Ricostituzione dell enzima ggiungere al Reagente enzima di idrolisi (contenente ml) 9 ml di Reagente B soluzione tampone per idrolisi. gitare per inversione Release 6 Oppiacei urinari in Fluorimetria Settembre

5 FSE : Idrolisi enzimatica dei campioni Fare una Curva di Calibrazione su punti. Reagente urinario - Reagente P urinario 6- - Reagente urinario Reagente P urinario 6- - Reagente urinario Reagente P urinario 6- - Reagente urinario Reagente P urinario 6- - Reagente urinario - Reagente P urinario 6- - Campione + P + P + P + P + P Campione Controlli + Controlli 6-, ml Controlli Controlli 6- Reagente Enzima ricostituito µl µl µl µl µl µl µl Controllare che il ph sia, Eventualmente correggerlo l vortex per secondi Release 7 Oppiacei urinari in Fluorimetria Settembre

6 .B. I valori dei Calibratori orfina, Codeina, Diidrocodeina e 6- mixati insieme avranno come concentrazione la ET di quella riportata nella tabella delle vvertenze!!! FSE : Porre in stufa a 6 C per ore. FSE : Condizionamento delle colonne di Clean-up Versare in colonna, ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento e Lavaggio Scartare l eluato Versare in colonna ml di Reagente D Soluzione di Condizionamento Eseguire questa fase lentamente Scartare l eluato FSE : Preparazione del Campione Dispensare in provetta : idrolizzato µl µl µl µl idrolizzato µl Campione Controlli Campione µl idrolizzato Controlli µl Reagente E Sol. Tampone µl µl µl µl µl µl µl gitare al Vortex FSE 6 : Versare tutti i campioni ed il precedentemente preparati nelle colonne di Clean-up e scaricare ad un flusso di ml/ minuto (goccia a goccia) anche con l ausilio di un vuoto moderato. FSE 7 : Lavaggio delle colonne di Clean-up: Lavare con ml di Reagente F Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato Lavare con ml di Reagente G Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato Lavare con ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento e Lavaggio Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria Release 7 Oppiacei urinari in Fluorimetria Settembre 6

7 FSE 8 : Eluizione Eluire con 8 µl di Reagente H Soluzione di Eluizione Portare a secco, raccogliere l eluato ed agitare al vortex FSE 9 : ggiungere all eluato µl di Reagente I Sol. Stabilizzante gitare accuratamente al Vortex IIEZIOE : Iniettare µl nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Release 7 Oppiacei urinari in Fluorimetria Settembre 7

8 REGETE L: SOLUZIOE TEST ORFI OPPICEI urinari - vvertenze ORFI circa. ng/ml REGETE L: SOLUZIOE TEST DIIDROCODEI DIIDROCODEI circa. ng/ml REGETE L: SOLUZIOE TEST 6-6-OOCETILORFI circa. ng/ml REGETE L: SOLUZIOE TEST CODEI CODEI circa. ng/ml REGETE ---- : CLIBRTORI LIOFILI URIRI Lot. orfina Diidrocodeina Codeina odalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. ggiungere esattamente ml di H O di grado HPLC e agitare delicatamente per min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 6 mesi se conservati a 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 8 C e mese a C. on usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : x x ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo..b.: una volta ricostituiti i calibratori vanno stoccati separatamente.,,7, 9,8 6,, 6,,7 87,8, 6,, 8

9 REGETE P-P-P-P-P : CLIBRTORI LIOFILI URIRI 6 Lot. 6-onoacetilmorfina odalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. ggiungere esattamente ml di H O di grado HPLC e agitare delicatamente per min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 6 mesi se conservati a 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 8 C e mese a C. on usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : x x ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo..b.: una volta ricostituiti i calibratori vanno stoccati separatamente. ng /ml 9, ng /ml 7,8 ng /ml 8, ng/ml 777, ng/ml PRETRI DEL DETECTOR FLUORIETRICO Varian λ EX λ E SESIBILIT' STRUETLE TEPO DI ITEGRZIOE nm nm -edium per orfina High per le altre secondi PROTEZIOE DELL COLO LITIC Per salvaguardare il sistema completo PURSUIT XRs C8 ( x,6 mm, µ) è tassativo l uso del etasaver Precolumn Filter. um ( x pz), cod. Z6. CODIZIOETO DELL COLO Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase PURSUIT C8,6 mm x mm, µm. Disconnettere il detector e far passare ml di una soluzione di H O : etanolo ( : 8 v/v ) e successivamente ml di H O per HPLC, al flusso di, ml / minuto. on riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di, ml / minuto e scaricare i primi ml. l termine, iniettare il test chimico e verificare la congruità della separazione. O è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Il segnale che la fase mobile deve essere cambiata è dato dal significativo innalzamento del rumore di fondo del detector Fluorimetrico. Se la T mb del Laboratorio è > C si consiglia di conservate a -8 C la Fase obile fra una seduta analitica e l altra. PULIZI DELL COLO PRETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare ml di H O e scaricare. Flussare una soluzione di H O : etanolo ( : 8 v/v ) per minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare ml di H O prima di condizionarla con la Fase obile. LOOP µl Flusso di lavoro consigliato,8 ml / minuto Pressione corrispondente Circa 8 bar PRETRI ITEGRTORE HP 9 / 9 / 96 TTEUZIOE 7 o 8 9

10 PRETRI COPUTER GESTIOLE SECODO LE SPECIFICHE DEL SOFTWRE GESTIOLE CCESSORI E COSUBILI CODICE DESCRIZIOE COFEZIOE CC6 urinario per Oppiacei x x ml CC7 Controllo multiparametrico per Oppiacei urinari 6 x ml CC8 Controllo multiparametrico per Oppiacei urinari 6 x ml CC9 Controllo multiparametrico per Oppiacei urinari Livelli e x 6 x ml CC6 per 6- urinaria x x ml CC87 Controllo per EDDP, 6- e Cocaina urinari 6 x ml CC88 Controllo per EDDP, 6- e Cocaina urinari 6 x ml CC89 Controllo per EDDP, 6- e Cocaina urinari Livelli e x 6 x ml Z6C6 Sistema completo Colonna nalitica Pursuit XRs C8 ( x,6mm - um) PZ Z6R6 Colonna interna Pursuit XRs C8 PZ Z6CG Precolonna interna per Pursuit XRs C8 x PZ Z6 etasaver Precolumn Filter. um x PZ S97U Vial di vetro a volume ridotto da, ml a ul + tappini x PZ

11 Oppiacei urinari (Cromatogrammi di riferimento) FL units..dt FL units C O.DT F I OR D EI O O C R DID I O DE C F I OR D EI O O C R DID 6 - I O DE C RT [min] RT [min] 7 Fig. : Soluzione Test Fig. : urinario R.T.. ORFI R.T..8 ORFI 77 ng/ml R.T. 9.6 DIIDROCODEI R.T DIIDROCODEI 8 ng/ml R.T..7 6-OOCETILORFI R.T..7 6-OOCETILORFI 7 ng/ml R.T..88 CODEI R.T..9 CODEI ng/ml

12 Oppiacei urinari (Cromatogrammi di riferimento) FL units O.DT FL units F I OR D EI O O C R DID I O DE C O.DT F I OR D EI O O C R DID 6 - I O DE C RT [min] RT [min] 7 Fig. : Controllo basso Fig. : Controllo alto R.T..8 ORFI 9 ng/ml R.T..8 ORFI 8 ng/ml R.T DIIDROCODEI 9 ng/ml R.T. 9.6 DIIDROCODEI 7 ng/ml R.T..7 6-OOCETILORFI ng/ml R.T..7 6-OOCETILORFI 8 ng/ml R.T..9 CODEI 6 ng/ml R.T..9 CODEI ng/ml