PREPARAZIONE E ANALISI DELL RNA

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Floriana Venturini
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1 PREPARAZIONE E ANALISI DELL RNA

2 Ruolo dell RNA nella cellula Il celebre dogma centrale formulato nel 1956 da F. Crick afferma che l informazione genetica fluisce nel senso: trascrizione traduzione Replicazione: DNA RNA proteine L RNA è un messaggero dell informazione contenuta nel DNA DNA transcription transcription transcription rrna (ribosomal) mrna (messenger) trna (transfer) Ribosome translation Protein

4 TRIZOL REAGENT PROCEDIMENTO Omogenizzazione ( lisi cellule e tessuto) in Trizol Reagent Fase di separazione (fenolo-cloroformio) Fase di precipitazione dell RNA( alcool isopropilico) Lavaggio dell RNA (in etanolo al 75%) Portare in soluzione l RNA ( acqua priva d RNAsi, incubazione a C)

5 FASE DI SEPARAZIONE

11 Schema trasferimento

12 Assemblaggio del blot capillare vaschetta tampone carta 3MM } carta 3MM membrana nylon gel supporto

13 Schema ibridazione

14 Northern Blot (una tecnica per misurare l espressione dell mrna) mrna estratto e purificato mrna viene trasferito dal gel su membrana mrna caricato per elettroforesi Lane 1: standard. Lane 2: RNA da testare. L RNA migra in un campo elettrico dal polo negativo al polo positivo in relazione al suo peso - + Una sonda marcata per un RNA specifico iene incubata con la membrana. L RNA a cui siamo interessati viene identficato

16 Malattie correlate all Asbesto L amianto appartiene alla famiglia di silicati cristallini idrati, strutturati sotto forma di fibre. Studi epidemiologici hanno correlato l esposizione professionale e ambientale all amianto alle seguenti lesioni: placche fibrose localizzate o fibrosi pleurica diffusa fibrosi interstiziale parenchimale (asbestosi) mesotelioma carcinoma della laringe e forse altre neoplasie extrapolmonari, fra cui il carcinoma nel colon Per questa ragione fin dal 1994 l amianto è stato abbandonato e ne è vietata per legge l estrazione, la lavorazione ed il commercio (da notare che la relazione fra la presenza dell asbesto e l insorgenza dei tumori era già scientificamente dimostrata fin dagli anni 60).

17 Questi minerali: sono altamente fibrosi si trovano nell ambiente non hanno alcun odore o sapore chiaramente individuabili sono molto resistenti al calore ed alla maggior parte delle sostanze chimiche sono facilmente lavorabili venivano ricavati per lo più da miniere a cielo aperto in seguito alla macinazione della roccia madre e successivo arricchimento sono ampiamente utilizzati nella produzioni di diversi tipi di materiali

18 Tra gli innumerevoli prodotti contenenti amianto si ricordano: corde, nastri e guaine per la coibentazione di tubazioni, di cavi elettrici vicini a sorgenti di calore intenso come forni, caldaie, ecc.; tessuti per il confezionamento di tute protettive antifuoco, coperte spegnifiamma, ecc.; carta e cartoni utilizzati come barriere antifiamma, ecc.; pannelli di fibre grezze compresse impiegati per la coibentazione di tubazioni; filtri costruiti con carta di amianto, o semplicemente con polvere compressa, utilizzati nell'industria chimica ed alimentare. dall impasto con altri materiali si ottenevano l amianto a spruzzo, utilizzato: come isolante termico nei cicli industriali con alte temperature (es. centrali termiche) come isolante termico nei cicli industriali con basse temperature (es. impianti frigoriferi, impianti di condizionamento); come isolante termico e barriera antifiamma nelle condotte per impianti elettrici. E' stato impiegato, inoltre, nel settore dei trasporti per la coibentazione di carrozze ferroviarie, di navi, di autobus, ecc..

19 La tabella illustra i sei differenti tipi di amianto presenti in natura: AMIANTO o ASBESTO SERPENTINO silicato di magnesio ANFIBOLI Silicati di calcio e magnesio CRISOTILO (amianto bianco) ACTINOLITE TREMOLITE Dal nome della Val Tremola Svizzera ANTOFILLITE Dal greco: garofano AMOSITE (amianto bruno) Acronimo di "Asbestos" "Mines of South Africa" Nome commerciale dei minerali grunerite e cummingtonite CROCIDOLITE (amianto blu) Dal greco fiocco di lana Varietà fibrosa del materiale riebeckite

20 È una varietà di serpentino e rappresenta la forma di amianto, detta amianto bianco, più usata nell industria Entrambe sono anfiboli, e anche se meno frequenti sono più patogenici, soprattutto per quanto riguarda l induzione di tumori pleurici maligni (mesoteliomi GLI ANFIBOLI SONO PIU PATOGENI DEI CRISOTILI!!!!!

21 LA MAGGIORE PATOGENICITA DEGLI ANFIBOLI SEMBRA CORRELATA ALLE PROPRIETA AERODINAMICHE E ALLA SOLUBILITA DELLE FIBRE DIRITTE E RIGIDE LA STRUTTURA SPIRALIFORME DEI CRISOTILI E PIU ADATTA A VENIR COMPRESSA DURANTE IL PASSAGGIO NELLE VIE AEREE SUPERIORI E RIMOSSA DALL APPARATO CILIARE, INOLTRE, ESSENDO PIU SOLUBILI VENGONO FILTRATI DAI TESSUTO DOPO IL LORO INTRAPPOLAMENTO NEI POLMONI

22 PATOGENESI Lo sviluppo della patologia dipende: dalla concentrazione dalle dimensioni e dalla forma dalla solubilità delle particelle di amianto

23 GLI ANFIBOLI, DRITTI E RIGIDI, SEGUONO IL FLUSSO AEREO, VENGONO TRASPORTATI IN CORRISPONDENZA DELLE ZONE DI BIFORCAZIONE DEGLI ALVEOLI, S INCUNEANO NELLE CELLULE EPITELIALI E RAGGIUNGONO L INTERSTIZIO SIA I MACROFAGI ALVEOLARI CHE QUELLI INTERSTIZIALI COMINCIANO A FAGOCITARE ED ELIMINARE LE FIBRE E QUESTA ATTIVITA VIENE INCREMENTATA DALLA LIBERAZIONE DI FATTORI CHEMOTATTICI E DI MEDIATORI FIBROGENECI CHE NE AMPLIFICANO LA RISPOSTA. LA DEPOSIZIONE CRONICA DI FIBRE E IL CONTINUO RILASCIO DI MEDIATORI CONDUCE ALLIFIAMMAZIONE DELL INTERSTIZIO CON CONSEGUENTE FIBROSI INTERSTIZIALE CORPUSCOLI DI ASBESTO SONO PRESENTI NEL TESSUTO, SONO RIVESTITE DA MATERIALE PROTEICO CONTENENTE FERRO, APPAIONO DI COLORE BRUNASTRO DORATO HANNO UNA FORMA FUSATA O A BACHETTA DI TAMBURO. ESSE APPAIONO QUANDO LE FIBRE VENGONO FAGOCITATE DAI MACROFAGI E IL FERRO DERIVA, PRESUMIBILMENTE, DALLA FERRITINA FAGOCITATA IL TESSUTO FIBROSO DISTORCE L ARCHITETTURA PRIMITIVA, CREANDO SPAZI AEREI DILATATI CIRCONDATI DA SPESSE PARETI FIBROSE E NELL INSIEME ASSUMONO L ASPETTO DI FAVO D API

24 Dall osservazione al microscopio: Colorazione giallo bruna e si colora fortemente con i Blu di Prussia per via del ferro Le fibre sono parzialmente inglobate dai macrofagi, poichè sono troppo grandi per una cellula sola

25 Nei lavoratori esposti all amianto possono svilupparsi sia il carcinoma broncogeno sia il mesotelioma (pleurico e peritoneale): per il carcinoma broncogeno il rischio è 5 volte superiore il rischio di sviluppare il mesotelioma (tumore molto raro con bassa incidenza 2-17 casi per ) è 1000 volte maggiore Dati sperimentali dimostrano che il fumo di sigaretta aumenta notevolmente il rischio per il carcinoma broncogeno, ma non il mesotelioma L amianto si comporta sia da agente inziante che promovente del processo Cancerogenetico

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