Southern blot. !Per. determinare la presenza o assenza di specifici frammenti genici. !Studio. della struttura e dell organizzazione di un gene

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1 Southern blot!per determinare la presenza o assenza di di specifici frammenti genici!studio della struttura e dell organizzazione di di un gene

2 Southern blot Procedura Isolare DNA genomico Digerirlo con enzima di di restrizione specifico Elettroforesi dei frammenti di di DNA su su gel d agarosio Denaturare il il DNA per separare i i filamenti complementari Trasferire il il DNA su su membrana per capillarità Ibridazione con una sonda marcata

3 Southern blot Gel Lastra autoradiografica

4 Trasferimento dal gel d agarosiod alla membrana per capillarità 500g Membrana Gel Blotting paper Supporto Transfer buffer Blotting paper

5 Dopo il trasferimento il DNA va fissato covalentemente alla membrana: -irradiazione UV per nylon -cottura 2 h 80 C C per nitrocellulosa 500g Membrana Gel Blotting paper Supporto Transfer buffer Blotting paper

6 Il Southern blot nello studio della variabilità genetica Una conseguenza della variabilità genetica è: RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Quattro individui che presentano una diversa distribuzione dei siti di restrizione nel medesimo locus genico

7 ! Analisi forense Southern blot applicazioni pratiche! Diagnosi di di malattie ereditarie ((es.: fibrosi cistica, distrofia muscolare, ecc.)! Individuazione di di agenti patogeni nelle infezioni! Analisi filogenetiche! Mappatura del genoma! Controllo degli OGM Vantaggi Svantaggi! Elevata specificità! Metodologia Metodologia che che richiede richiede tempo tempo! Richiede, Richiede, inoltre, inoltre, discrete discrete quantità quantità di di DNA DNA (bassa (bassa sensibilità) sensibilità)

8 Northern blot!per determinare la dimensione e la la quantità di di specifici RNA!Studi sull espressione genica

9 Northern blot Procedura Isolare l RNAl Elettroforesi dell RNA su su gel (agarosio( o PAGE) Trasferire l RNA l su su membrana (nylon) Ibridazione con una sonda marcata

10 Controllo di trasferimento con bromuro d etidio 28S 18S prima dopo Gel Membrana

11 Elettroblot (per gel di poliacrilammide) ON 10V 80 ma Membrana (nylon) gel blotting paper Buffer TB 0.5X gel (acrilammide) blotting paper Membrana (nylon) Polo - blotting paper Polo +

12 Ibridazione Le sonde utilizzate possono essere:! Oligonucleotidi a DNA marcati terminalmente con radioattivo! DNA a doppio filamento marcati in continuo con radioattivo! Oligonucleotidi a RNA marcati terminalmente con radioattivo! Ribo-probe (RNA marcati in continuo)

13 Ibridazione

14 Ibridazione La sonda marcata e aggiunta alla membrana con l RNA da analizzare in tubi da ibridazione (circa 16 ore in stufe termostatate) in presenza di apposite soluzioni di ibridazione. 37 C C o 42 C C o ecc. Sonda marcata 16h Soluzione di ibridazione SSPE o SSC Denhard sol. SDS Formammide ssdna

15 Lavaggio Dopo l ibridazionel ibridazione, va rimossa la sonda non legata o legata in modo aspecifico alla membrana. Si procede quindi a lavaggi successivi a una temperatura specifica con soluzioni a sale sempre più basso (SSPE o SSC). L ibridazione molecolare è sfavorita in condizioni di alta temperatura e basso sale. Verranno rimosse prima le molecole di sonda legate più debolmente (aspecificamente aspecificamente) alla membrana. Esempio: lavaggio di una membrana a 37 C C con SSPE SSPE 6X SSPE 2X SSPE 0,2X Membrana ibridata Rimozione progressiva della sonda Membrana lavata

16 Rivelazione dei segnali I segnali vengono rivelati mediante autoradiografia con apposite lastre fotografiche Schermo intensificatore Membrana ibridata e lavata Lastra fotografica

17 Rivelazione dei segnali Soluzione di sviluppo Soluzione di fissaggio Lastra esposta al filtro Lastra sviluppata A B C D A B C D X Gel Lastra

18 Disibridazione della membrana Per rimuovere l ibridazione il filtro si fa bollire in H 2 O distillata e SDS (detergente) Membrana ibridizzata H 2 O SDS 0,1% 100 C Membrana disibridata La stessa membrana può quindi essere ibridizzata più volte con sonde diverse

19 Alcune applicazioni In quali tessuti è espresso il trascritto?

20 2. Come varia l espressionel del trascritto? controllo di caricamento U2 snrna stimolo , , ,00 mir-98 mir-124a mir-124a , ,00 mir ,00 0,00 assenza di stimolo + stimolo

21 3. Caratterizzazione isoforme di splicing 5 XIII XIV 3 cdna Isoforma A SPLICE SITES 5 XIII XIV 3 pre-mrna probe 5 3 XIII XIV cdna Isoforma B 2500 nt 2000 nt Isoforma A Isoforma B