Variazioni del genoma possono determinare:

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Geronima Ferrara
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1 Variazioni del genoma possono determinare: Insorgenza di malattie genetiche Differente predisposizione a determinate patologie Differente risposta a specifiche terapie Differente risposta a stress ambientali, a virus, a tossine

determinate patologie Differente risposta a specifiche

2 Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Individui affetti Identificazione eterozigoti (malattie ad eredita mendeliana) Presintomatici (malattie ad esordio tardivo) Suscettibilità genetica Risposta a specifiche terapie (fenotipi complessi)

mendeliana) Presintomatici (malattie ad esordio tardivo)

3 Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Individui affetti Diagnosi preimpianto Diagnosi prenatale Diagnosi neonatale Identificazione eterozigoti Consulenza genetica (malattie ad eredita mendeliana)

prenatale Diagnosi neonatale Identificazione

4 Examples of Inherited Disorders Detectable by PCR Disease Affected Gene Severe-combined immunodeficiency, SCID adenosine deaminase (ADA) Lesch-Nyhan syndrome hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) α 1 -Antitrypsin deficiency α 1 -Antitrypsin Cystic fibrosis cystic fibrosis transmembrane conductance (CFTR) protein Fabry disease α-galactosidase Gaucher disease acid β-glucosidase (glucocerebrosidase) Sandhoff disease hexosaminidase A and B Tay-Sachs disease hexosaminidase A Familial hypercholesterolemia (FH) LDL receptor Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency glucose-6-phosphate dehydrogenase Maple syrup urine disease branched-chain α-keto acid dehydrogenase Phenylketonuria (PKU) phenylalanine hydroxylase Ornithine transcarbamylase deficiency ornithine transcarbamylase Retinoblastoma (Rb) RB gene product, prb Sickle-cell anemia point mutation in β-globin β-thalassemia mutations in β-globin gene that result in loss of synthesis of protein Hemophilia A Factor VIII Hemophilia B Factor IX

acid β-glucosidase (glucocerebrosidase) Sandhoff disease hexosaminidase A and B Tay-Sachs disease hexosaminidase A Familial hypercholesterolemia (FH) LDL receptor Glucose-6-phosphate dehydrogenase

5 Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Suscettibilità genetica Presenza di mutazioni a geni oncosoppressori BRCA1- BRCA2 cancro al seno Risposta a specifiche terapie Ricerca delle mutazioni K-Ras nel carcinoma al colon (fenotipi complessi)

oncosoppressori BRCA1- BRCA2 cancro al seno Risposta a

Le ricerche sono state condotte sul cetuximab, un anticorpo monoclonale utilizzato per il trattamento del cancro del colon-retto metastatico ed è stato individuato un gene (KRAS) che predice

6 Le ricerche sono state condotte sul cetuximab, un anticorpo monoclonale utilizzato per il trattamento del cancro del colon-retto metastatico ed è stato individuato un gene (KRAS) che predice l'efficacia di questa molecola sul paziente. I risultati mostrano che il cetuximab funziona meglio nei pazienti che non presentano mutazioni in questo marcatore. Questa scoperta è un altro decisivo passo avanti verso la messa a punto di terapie sempre più mirate e su misura per il paziente.

I risultati mostrano che il cetuximab funziona meglio nei pazienti che non presentano mutazioni in questo marcatore.

8 Una mutazione puntiforme nel gene, che codifica per la proteina Ras, riduce la sua attività GTPasica rendendola costitutivamente attiva.

9 Cetuximab è un anticorpo monoclonale che blocca il recettore dell EGF. La proteina Ras si trova a valle di EGFR, quindi anche bloccando il recettore non si ottiene la risposta desiderata (blocco della proliferazione cellulare)

10 Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras nella biopsia del paziente

11 Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Preparazione dei campioni: (Estrazione del DNA o dell RNA dal tessuto di interesse) Analisi delle mutazioni: SSCP DHPLC Dot blot - Southern - PCR (ARMS Enzimi di restrizione) Real-Time PCR (Discriminazione allelica) - RT-PCR Analisi HT

Analisi delle mutazioni: SSCP DHPLC Dot blot - Southern - PCR (ARMS

12 Diagnosi attraverso l analisi molecolare mrna DNA

13 Diagnosi attraverso l analisi molecolare mrna a. RT-PCR b. Protein Truncation Test (PTT)

14 a. RT-PCR RT-PCR permette di evidenziare variazioni nella lunghezza dell mrna (delezioni) oppure modulazioni del livello dei trascritti (mutazioni nei siti di regolazione dell espressione). Può essere vantaggiosa nel caso si analizzi un gene di notevoli dimensioni (distrofina).

(mutazioni nei siti di regolazione dell espressione).

15 The dystrophin gene is the largest gene found in nature, measuring 2.4 Mb. 79 exons

16 L analisi viene condotta operando inizialmente una reazione enzimatica di amplificazione del DNA, conosciuta come Polymerase Chain Reaction (PCR), che consente di amplificare in vitro una specifica regione della molecola, copiandola in varie fasi successive, fino ad ottenerne milioni di copie. In tale maniera vengono amplificati, mediante amplificazione genica fluorescente multipla, 18 esoni del gene della Distrofina, così ripartiti: Il sistema, realizzato seguendo le linee guida del gruppo collaborativo europeo per la diagnosi molecolare della Distrofia DMB/DMD (EMQN), permette di evidenziare circa il 98% delle delezioni del gene della Distrofina. Exon Size DYE Exon Size DYE (bp) (bp) exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM exon HEX exon FAM

In tale maniera vengono amplificati, mediante amplificazione genica fluorescente multipla, 18 esoni del gene della Distrofina, così ripartiti: Il sistema, realizzato seguendo le linee guida del

17 b. Protein Truncation Test (PTT) Il PTT è un test che permette di mettere in evidenza la formazione di una proteina tronca. Naturalmente non permetterà di conoscere il tipo di mutazione che ha causato l evento

18 PTT Protein Truncation Test È un test specifico per mutazioni frameshift, nonsense, splice site che portano alla produzione di una proteina tronca (Neurofibromatosi, Distrofia di Duchenne)

19 Amplificazione del cdna Presenza al 5 : di un promotore, sito di inizio della trascrizione Una sequenza specifica che permetta il giusto frame di lettura Il prodotto di PCR viene messo in contatto con un sistema di trascrizione e traduzione che costruisce il polipeptide corrispondente, le cui dimensioni vengono analizzate su gel di poliacrilamide con SDS. Polipeptidi tronchi avranno dimensioni minori rispetto a quelle di controllo.

di trascrizione e traduzione che costruisce il polipeptide corrispondente, le cui dimensioni vengono

20 Diagnosi attraverso l analisi molecolare DNA a. Mutazioni non necessariamente caratterizzate b. Specifiche mutazioni

21 Amplificazione della sequenza da analizzare (PCR) Individuazione dei prodotti mediante sonde specifiche (Ibridazione)

22 a. Mutazioni non necessariamente caratterizzate Mobilità elettroforetica di heteroduplex Single-strand conformation polymorphism (SSCP) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Mismatch cleavage enzimatico chimico

26 SSCP Analisi di polimorfismi di DNA a singola elica Amplificazione mediante PCR del frammento di DNA da analizzare. Denaturazione. Elettroforesi su gel di poliacrilamide non denaturante del DNA da analizzare e di un DNA di controllo.

27 In presenza di mutazione la diversità di conformazione del DNA a singola elica determinerà differenze nella velocità di migrazione.

28 DGGE denaturing gradient gel electrophoresis DHPLC denaturing high performance liquid cromatography Sfruttano le proprietà del DNA eteroduplex, in gradiente di denaturazione, per poter individuare sequenze che differiscono anche per una sola base

30 Questi metodi non individuano la posizione e il tipo di mutazione. Non permettono di discriminare tra una mutazione che provoca un alterazione nel prodotto proteico ed un semplice polimorfismo del DNA.

31 Per conoscere quindi se la mutazione messa in evidenza può causare un fenotipo patologico occorre ricorrere al sequenziamento

32 b. Specifiche mutazioni La mutazione che causa la malattia è unica ( Falcemia ) Effetto del fondatore o vantaggio degli eterozigoti ( btalassemia Fibrosi cistica ) La malattia è causata da uno specifico meccanismo molecolare ( Corea di Huntington FraX )

33 b. Specifiche mutazioni Digestione con enzimi di restrizione di DNA amplificato con PCR; controllo della grandezza dei frammenti su gel Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad oligonucleotidi allele specifici (ASO) Amplificazione di DNA usando primers allele specifici (ARMS) PCR con primers localizzati agli estremi di una delezione o di un breakpoint di traslocazione Individuazione del numero di triplette ripetute

34 Digestione con enzimi di restrizione di DNA amplificato con PCR; controllo della grandezza dei frammenti su gel

36 M bp 165 bp Analisi della mutazione N1303K (gene CFTR: 4041 C>G) In questo caso la mutazione crea un sito di restrizione per l enzima DdeI (CTNAG), perciò l'enzima taglia il DNA con la mutazione (+ presenza della mutazione; - mutazione assente; M = marcatore di peso molecolare)

37 Scomparsa di un sito BclI nel gene del fattore VIII

38 Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad oligonucleotidi allele specifici (ASO)

39 ARMS Amplification refractory mutation system (amplificazione allele specifica) Si eseguono due amplificazioni parallele. Uno dei primer è comune ad entrambe le reazioni; l altro in una reazione è specifico per l allele normale, nell altra per l allele mutato

40 PCR allele specifica

41 Multiplex ARMS test per individuare 4 specifiche mutazioni che causano la fibrosi cistica

42 PCR con primers localizzati agli estremi di una delezione o di un breakpoint di traslocazione

43 X fragile (309550) Frequenza: 1/4000 maschi. Ereditarietà: Legata al cromosoma X. Malattia causata da mutazione dinamica. Genetica: Nel 1991 è stato identificato il gene responsabile. La mutazione è caratterizzata dall amplificazione di un tratto di DNA costituito da una specifica sequenza ripetuta (CGG). Nei soggetti normali è presente un numero di ripetizioni variabili da 6 a 55. Esistono due differenti tipi di mutazione: la premutazione (56-200) e la mutazione completa (>200). La probabilità di espansione aumenta con le dimensioni della premutazione e quindi con il passare delle generazioni (Paradosso di Sherman). Diagnosi: La diagnosi molecolare (Southern blot) permette di individuare anche gli individui con la premutazione.

45 Diagnosi di malattie da espansione di triplette ripetute

46 Real Time PCR

47 Per ogni campione da analizzare utilizzo 2 differenti sonde marcate con 2 differenti fluorofori 1) Complementare all allele wild type 2) Complementare all allele mutato e la stessa coppia di primers

48 Discriminazione allelica

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