PCR allele-specifica Ibridazione con sonde allele-specifiche (ASO) PCR Real-time con sonde TaqMan Saggio OLA (Oligo Ligation Assay)

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1 Tecniche per l analisi di singole variazioni: PCR allele-specifica Ibridazione con sonde allele-specifiche (ASO) PCR Real-time con sonde TaqMan Saggio OLA (Oligo Ligation Assay)

2 alcuni SNP (ca. 10%) sono anche RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) polimorfismi (bi-allelici) in cui i due alleli differiscono per la dimensione dei frammenti generati da una reazione di digestione enzimatica DNA genomico BamHI BamHI* BamHI 6.4kb 14.6kb

3 RFLP inizialmente sono stati studiati utilizzando il Southern blot: procedimento lungo, costoso e che richiede notevoli quantità di DNA di partenza Oggi si studiano accoppiando la PCR alla digestione enzimatica, i prodotti di digestione vengono separati su gel di agarosio e visualizzati su un transilluminatore DNA genomico BamHI BamHI* BamHI 6.4kb 14.6kb 0.4kb BamHI* 0.7kb Digestione del prodotto della PCR con BamHI elettroforesi

4 BamHI* 200 bp 400 bp M 600 bp 400 bp 200 bp

5 PCR con primer allele-specifici ARMS - Amplification Refractory Mutation System Per ciascun campione si effettuano separatamente due reazioni di PCR. Un primer è comune ad entrambe le reazioni, l altro è presente in due versioni che differiscono per il solo nucleotide all estremità 3 : uno si appaia alla sequenza normale, l altro a quella mutata. Nelle reazioni di PCR viene inclusa anche una seconda coppia di primer di controllo che amplifica una regione di dimensioni differenti da quella in esame (controllo positivo di PCR).

6 Omozigoti allele 1 amplificazione con primer 1 positiva, con primer 2 negativa Omozigoti allele 2 amplificazione con primer 1 negativa, con primer 2 positiva Eterozigoti amplificazione con primer 1 positiva, con primer 2 positiva In alcuni casi è possibile disegnare i primer in modo da effettuare le due reazioni allele-specifiche in un unica provetta

7 La ARMS-PCR può essere applicata all analisi simultanea di differenti mutazioni. I primers devono essere scelti in modo da ottenere, per le diverse mutazioni, amplificati di dimensioni differenti che siano quindi facilmente separabili su gel Esempio di ARMS-PCR multipla per la ricerca di 4 diverse mutazioni del gene della Fibrosi Cistica

8 La stabilità di un doppio filamento di DNA con un unico mismatch diminuisce al diminuire della lunghezza della sonda

9 La stabilità di una molecola di DNA a doppio filamento con un unico mismatch diminuisce al diminuire della lunghezza della sonda

10 Saggi TaqMan in RT-PCR

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12 Genotipizzazione con sonde TaqMan Omozigote per l allele 1 Eterozigote 1-2 Omozigote per l allele 2

13 PCR Aumento della quantità del prodotto ( target ) in funzione del numero di cicli

14 OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) Si utilizzano due primer Allele Specifici (ASO) + un primer comune, quest ultimo è complementare alla sequenza immediamente fiancheggiante la mutazione. Primer ASO e primer comune si congiungono nel punto della mutazione La DNA-ligasi lega covalentemente i due oligo solo se essi si appaiano in maniera perfetta al frammento di DNA

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16 La scelta opportuna di primers e di fluorocromi permette l analisi simultanea di parecchie mutazioni diverse

17 DOT BLOT Reazioni di PCR bersaglio vengono immobilizzate su due distinte membrane di nitrocellulosa o nylon Le membrane vengono sottoposte a trattamento denaturante (calore o agenti chimici) e messe in contatto con la soluzione contenente la sonda ASO marcata (radioattivo o altro tipo di marcatura. Una delle due membrane viene fatta reagire con la sonda wild-type l altra con quella mutante Si eseguono dei lavaggi per eliminare le sonde che non si sono ibridate perché non perfettamente complementari al DNA target Tramite autoradiografia (o con altro metodo che dipende dal tipo di marcatura) si evidenziano i campioni che si sono appaiati in maniera perfetta con il probe

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19 Molto spesso si utilizza il REVERSE DOT BLOT: le sonde oligonucleotidiche non sono marcate e vengono fissate sulla membrana, mentre il DNA bersaglio viene marcato e fornito in soluzione. Il legame tra il DNA bersaglio (marcato) e l oligonucleotide specifico attaccato alla membrana indica la presenza della sequenza specifica nel bersaglio.

20 Principio su cui si basa il REVERSE DOT BLOT

21 Sonde normali Sonde mutate RDB multiplo: analisi di 36 mutazioni CF Strip A 19 mutazioni CF Strip B 17 mutazioni CF Sonde mutate Sonde normali