Marcatori genetici delle piante

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1 Marcatori genetici delle piante Marcatore genetico: locus genico che identifica univocamente una regione cromosomica Polimorfismo genetico: Presenza di varianti alleliche per un dato locus (gene o marcatore) Polimorfismo molecolare: Differenze evidenziabili a livello di DNA Mappa genetica: definisce le relazioni lineari tra marcatori molecolari E IL RISULTATO DELL ANALISI GENETICA Distanza genetica tra due marcatori. Viene calcolata sulla frequenza di ricombinazione e si esprime in centimorgan (cm) 1 cm = 1 ricombinante / 100 prodotti meiotici

2 Marcatori genetici delle piante marcatori morfologici; analisi del fenotipo (es. pigmentazione) marcatori citogenetici; analisi microscopica (es. eterocromatina) marcatori biochimici; analisi elettroforetica (es. isoenzimi) marcatori molecolari (m.m.), analisi del DNA. Caratteristiche ideali dei marcatori genetici: Ubiquitarietà e facilità di reperimento nel genoma Non influenzati dall'ambiente Non influenzati dallo stadio di sviluppo e dal sesso Elevato livello di polimorfismo al singolo locus Assenza di dominanza Trasferibilità tra specie diverse Analisi automatizzabile Costi limitati di analisi

3 Marcatori molecolari (m.m.) I m.m. sono la categoria di marcatori genetici più interessanti. I costi elevati limitano il loro uso in programmi di miglioramento genetico Poichè esistono numerose categorie di m.m., la scelta va realizzata valutando i seguenti fattori. Costi di analisi Possibilità di automatizzare le analisi Possibilità di multiplexing Riproducibilità entro laboratorio e tra laboratori Trasferibilita tra specie affini Estrazione del DNA e sua qualita Riproducibilità dei risultati e qualità del DNA estratto.

4 Le tipologie di marcatori molecolari più tradizionali si basano sulla separazione elettroforetica del DNA, accoppiata ad un sistema di visualizzazione di frammenti specifici di DNA RFLP SSR RAPD AFLP

5 RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism Cause dei polimorfismi RFLP: variazioni nella sequenza dei siti di restrizione (SNP) riarrangiamenti genomici dovuti ad inserzioni o delezioni (indel) La causa più frequente di RFLP sono i riarrangiamenti genomici e non a variazioni di sequenza La tecnica RFLP comprende le seguenti fasi: 1 - estrazione del DNA nucleare 2 - restrizione del DNA nucleare (con enzimi 4- o 6-cutter) 3 - separazione dei frammenti di restrizione e loro denaturazione 4 - trasferimento del DNA denaturato su filtro (Southern blotting) 5 - ibridazione del filtro con sonde radioattive o chemioluminescenti 6 - evidenziazione del profilo di ibridazione 7 - rimozione della sonda dai filtri

6 RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism Figura Procedura per l analisi di marcatori RFLP. Fig , pag 799, Barcaccia Vol 3

7 RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism Figura (modificata) Natura del polimorfismo RFLP Fig , pag 799, Barcaccia Vol 3

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9 RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism - Problematiche relative all uso delle sonde RFLP Le sonde utilizzate per gli RFLP possono derivare da: cloni casuali di DNA genomico omologo (libreria genomica) cloni cdna (omologhi od eterologhi) ottenuti da mrna. Si preferiscono sonde costituite da geni a copia singola con bande ben distinguibili e assenza di background nella corsia. Sonde da geni ripetuti >>> autoradiogrammi non interpretabili Sonde ibridizzano con DNA di specie affini filogeneticamente RFLP forniscono strumento versatile per indagare le relazioni filogenetiche tra specie diverse

10 RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism Principali vantaggi degli RFLP: prevalentemente codominanti elevata ripetibilità entro laboratorio e trasferibilità tra laboratori ottima trasferibilità tra incroci entro specie e, a seconda della distanza filogenetica, anche tra specie diverse molte specie hanno mappe RFLP molto sature e permettono di scegliere la sonda in funzione delle esigenze di mappa. riconoscono più alleli allo stesso locus Principali svantaggi degli RFLP: costi rilevanti richiedono l uso di isotopi radioattivi non è possibile automatizzare la tecnica richiedono elevati quantitativi di DNA

11 RFLP a copia singola, a basso e ad alto numero di copie Marcatori RFLP a copia singola o a basso numero di copie, per applicazioni di mappaggio. A Utilizzo di marcatori RFLP con sonde ripetute nel genoma in studi di fingerprinting varietale e di distanza genetiche marcatori VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) B C Figura Esempi di profili RFLP Ottenuti con sonde singolo-locus in una popolazione segregante (A, B) e con sonda multi-locus (C). Figura Esempi di polimorfismi VNTR dovuti alla successione di un numero variabile di elementi ripetuti compresi tra due siti di restrizione. Figs e 17.17, pag 800, Barcaccia Vol 3

12 Marcatori basati sulla PCR RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA) SSR (Simple Sequence Repeat) STS (Sequence-Tagged Sites) CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) SCAR (Sequenced Characterized Amplified Regions) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms)

13 RAPD: Random Amplification Polymorphic DNA Introdotti agli inizi degli anni 90 Utilizzano come primer brevi oligonucleotidi (9-11 bp) che rivelano un numero variabile di frammenti ottenuti da regioni cromosomiche diverse e casuali. Il primer è molto corto poichè la probabilità che si trovino casualmente due sequenze ad esso complementari e distanti non più di ca bp sui filamenti opposti del DNA è tanto minore quanto maggiore è la lunghezza del primer. Una indel o SNP in uno o in entrambi i siti di appaiamento del primer impediscono l'amplificazione >>> m.m. dominante Inserzioni (fino a ca. 2 kp) o delezioni nel DNA compreso tra i primer >>> m.m. codominante; Una inserzione che, rispetto all'allele wild-type, produca una sequenza troppo lunga tra primer per consentirne l'amplificazione >>> m.m. dominante.

14 RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA Figura Rappresentazione schematica della natura del polimorfismo multi-locus dei marcatori RAPD (o AP-PCR). Fig , pag 803, Barcaccia Vol 3

15 RAPD: Random Amplification Polymorphic DNA MARCATORI RAPD A B C D Figura Esempi di profili RAPD: A) landrace di radicchio (primer OPA1); B) popolazione segregante di mais (primer OP-B20); C) linea inbred di mais (primer OP-C7); D) landrace di radicchio (primer M13). Fig , pag 804, Barcaccia Vol 3

16 RAPD: Random Amplification Polymorphic DNA Principali vantaggi dei RAPD: Non sono necessari dati di sequenza Automatizzabili Oligonucleotidi (primer) sono corti e universali Richiedono poco DNA di partenza La tecnica è facile Principali svantaggi dei RAPD: Limitata ripetibilità e trasferibilità Poichè la tecnica si basa su condizioni di relativa aspecificità, i risultati sono riproducibili solo se si opera con notevole precisione Prevalentemente (95%) dominanti

17 SSR: Simple Sequence Repeats Marcatori microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeats - Ripetizioni di sequenze semplici). Basati per lo più su PCR. Sfruttano la presenza, nei genomi, di corte ripetizioni di sequenze di-, tri- o tetranucleotidiche, per esempio del tipo (CA)n, oppure (AAAT)n, ecc., con n = numero di ripetizioni. Le sequenze ai lati della ripetizione, se a singola copia, sono utilizzate per progettare primer PCR. Al singolo locus SSR, il numero di ripetizioni è altamente variabile tra individui della stessa specie, generando un alto numero di alleli per marcatori. Gli alleli si differenziano per la lunghezza dei frammenti PCR amplificati, generando polimorfismi di tipo codominante.

18 SSR: Simple Sequence Repeats Figura Analisi dei marcatori microsatelliti (SSR). Figura Natura del polimorfismo SSR: l individuo eterozigote a/b mostra due bande mentre quelli omozigoti a/a e b/b soltanto una. Fig e 17.26, pag 806, Barcaccia Vol 3

19 SSR: Simple Sequence Repeats Esempio di analisi SSR in gel d agarosio Popolazione di piante F 2 derivata dall incrocio P1 x P2 P1 P2 F 1 Scala Elettroforesi in gel d agarosio ad alta concentrazione (3%) visualizzato con bromuro di etidio su transilluminatore UV. Marcatore SSR umc1001, prodotto da PCR standard. Popolazione sperimentale di piante di mais.

20 Profili microsatellitari (SSR) in frumento duro e tenero Sumai Carisma Esperia Aubosson Svevo Iride Norman no Maestrale Sumai Carisma Esperia Aubosson Svevo Iride Norman no Maestrale Sumai Carisma Esperia Aubosson Svevo Iride Norman no Maestrale Sumai Carisma Esperia Aubosson Svevo Iride Norman no Maestrale Xbarc360 Xbarc360 Xcfa2123 Xwmc494 Xbarc3 Xgwm526 a,b Xgwm099 Xcfa2123 Xwmc494 Xbarc3 Xgwm408 Xgwm570 Courtesy of Enrico Noli & colleagues, LARAS, DISTA

21 SSR multiplexati e rilevati in fluorescenza utilizzando sequenziatori capillari del DNA Da Barcaccia Vol 3

22 SSR: Simple Sequence Polymorphism Tabella 17.5 Elenco di SSR analizzati nelle piante.

23 SSR: Simple Sequence Polymorphism Tabella 17.6 Frequenza e distribuzione di microsatelliti nei genomi di alcune piante. Tab 17.6, pag 806, Barcaccia Vol 3

24 SSR: Simple Sequence Polymorphism Identificazione di marcatori SSR Tramite produzione e screening di librerie genomiche arricchite per sequenze SSR (Vedi figura successiva). Screening di librerie EST in database per identificazione di SSR intragenici, generalmente di tipo trinucleotidico, poco polimorfici anche se in genere a copia singola e facilmente e precisamente amplificabili. Screening di sequenze genomiche (interi genomi) da database pubblici.

25 SSR: Simple Sequence Polymorphism Principali vantaggi dei marcatori SSR: 1. necessitano di piccole quantità di DNA 2. analisi facilmente automatizzabile 3. non richiedono l uso di radioattività 4. si possono multiplexare 5. sono i m.m. che distinguono il maggior numero di alleli per singolo locus. Principali svantaggi dei marcatori SSR: 1. indispensabile conoscere, almeno in parte, la sequenza del locus da analizzare 2. l informazione di mappa non è facilmente trasferibile tra specie diverse 3. elevati costi per costituire una mappa di associazione iniziale.

26 STS, SCAR e CAPS STS (Sequence-Tagged Sites = siti riconosciuti tramite sequenza) sono marcatori a copia singola la cui specificità si ottiene con progettazione della PCR sulla base della sequenza target (es.sonda RFLP Tipi particolari di marcatori STS sono i marcatori SCAR (Sequence-Characterized Amplified Regions = regioni amplificate e specificate dalla sequenza), ottenuti dal sequenziamento di frammenti RAPD o AFLP. I marcatori STS e SCAR hanno basso polimorfismo e spesso risultano in frammenti amplificati di uguali dimensioni in diversi genotipi. CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) sono marcatori STS digeriti con uno o più enzimi di restrizione (es. 4-cutter) che aumentano il livello di polimorfismo, evidenziando differenze di sequenza in frammenti con medesima lunghezza.

27 STS, SCAR e CAPS Figura Procedura per lo sviluppo di marcatori SCAR e CAPS. Esempi di profili elettroforetici generati da marcatori SCAR e CAPS. Fig 17.37, pag 817, Barcaccia Vol 3

28 STS, SCAR e CAPS Principali vantaggi degli SCAR e dei CAPS: elevata ripetibilità poche decine di cellule sono sufficienti per ottenere il DNA necessario facilmente automatizzabili. Principali svantaggi degli SCAR e dei CAPS: indispensabile conoscere la sequenza da analizzare per gli SCAR: rischio di ottenere marcatori dominanti oppure poco polimorfici (ad eccezione di eventi di inserzioni/delezioni nella sequenza analizzata) per i CAPS: più costosi in quanto richiedono la digestione enzimatica del prodotto PCR. A rischio anche l affidabilità in quanto digestioni fallite corrispondono ad erronea genotipizzazione.

29 AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism Nel 1995 la Keygene brevetta gli AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism Polimorfismo per lunghezza dei frammenti amplificati). La tecnica si basa sull'amplificazione selettiva di frammenti di restrizione del DNA genomico. Sono previsti tre passaggi: digestione del DNA e successiva addizione di opportuni adattatori amplificazione limitata ad una porzione dei frammenti di restrizione separazione dei prodotti di amplificazione con elettroforesi in poliacrilamide. Il protocollo più utilizzato prevede l'uso di radioisotopi ( 33 P o 32 P) E il primo vero marcatore multilocus altamente efficiente ed affidabile. I polimorfismi sono per lo più di tipo presenza-assenza (e quindi dominanti). Gli AFLP si prestano bene alla saturazione delle mappe genetiche ed al fingerprinting varietale

30 AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism Figura Procedura per la rilevazione di marcatori AFLP comprendente la digestione del DNA con due distinti enzimi di restrizione, la ligazione di adattatori, la preamplificazione e l amplificazione finale con primer aventi una o più basi selettive. Fig 17.30, pag 811, Barcaccia Vol 3

31 AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism MARCATORI AFLP A B Figura Marcatori AFLP radioattivi: (A) prova di primer condotta con combinazioni Eco/Mse aventi tre basi selettive usando DNA genomico di Poa pratense (P) ed erba medica (M); (B) alleli marcatori AFLP segreganti in una popolazione sperimentale di mais. Fig 17.32, pag 812, Barcaccia Vol 3

32 AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism Note tecniche Il DNA genomico viene digerito con due enzimi di restrizione: - un rare cutter (R), che riconosce una particolare sequenza di 6 o 8 bp - un frequent cutter (F), che riconosce una sequenza di 4 bp. Per consentire di disegnare i primer, le poche basi rimaste del sito di restrizione non sono sufficienti, per cui i frammenti di restrizione vengono legati a degli adattatori specifici (15-20 bp) che forniscono quindi un sito di appaiamento adeguatamente lungo e stabile. Si effettua una prima amplificazione (preamplificazione); questo passaggio può essere evitato nello studio di genomi semplici (procarioti); lo scopo della preamplificazione è quello di incrementare la percentuale dei frammenti R-F. Ciò si ottiene utilizzando i primer per entrambi gli adattatori a cui può essere aggiunta una base selettiva. Segue poi la vera e propria amplificazione: per evitare l'amplificazione di un numero elevatissimo e quindi irrisolvibile di frammenti, si utilizzano primer che contengono uno o più nucleotidi discriminanti (fino a tre). Si esegue quindi l'elettroforesi in gel denaturante di poliacrilamide. Visualizzazione con metodi radioattivi (es. 33 P,) o chimici. (es. a AgNO3).

33 Profili AFLP di cultivar di frumento duro Courtesy of Enrico Noli & colleagues, LARAS, DISTA

34 I marcatori molecolari consentono di riconoscere, catalogare e utilizzare al meglio la variabilità naturale disponibile di una specie Dendrogramma dedotto da analisi con marcatori molecolari Varietà di grano duro