METODI DI BASE PER L ANALISI DEGLI ACIDI NUCLEICI

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1 METODI DI BASE PER L ANALISI DEGLI ACIDI NUCLEICI

2 SPETTRI UV E QUANTIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DEGLI ACIDI NUCLEICI

3 FIGURA 7.6A METODOLOGIA BIOCHIMICA (WILSON) a a = a 1 Assorbimento = a b a 1 b

4 FIGURA MONDUZZI

5 FIGURA 5.17A STRYER V

6 GLI ACIDI NUCLEICI MOSTRANO UN MASSIMO DI ASSORBIMENTO A 260 nm, MENTRE LE PROTEINE PRESENTANO L ASSORBIMENTO MASSIMO A 280 nm

7 LEGGE LAMBERTBEER: A = C x L x E A: ASSORBIMENTO AD UNA DETERMINATA LUNGHEZZA D ONDA C: CONCENTRAZIONE DELLA MOLECOLA IN ESAME L: PERCORSO OTTICO. E: IL COEFFICIENTE DI ESTINZIONE DELLA MOLECOLA IN ESAME.

8 I COEFFICIENTI DI ESTINZIONE PERCENTUALI A 260 nm SONO PARI A 200 O.D./cm PER IL DNA E 240 O.D./cm PER L RNA. C = A/ExL

9 ESERCITAZIONE: CALCOLARE LA CONCENTRAZIONE DI UNA SOLUZIONE DI DNA CHE PRESENTA UN ASSORBIMENTO A 260 nm PARI A 2 OD

10 DENATURAZIONE TERMICA DEL DNA E DETERMINAZIONE DELLA TEMPERATURA DI FUSIONE

11 PER DENATURAZIONE DEL DNA SI INTENDE LA PERDITA DELLA SUA STRUTTURA SECONDARIA CIOE LA SEPARAZIONE DELLE DUE CATENE POLINUCLEOTIDICHE. LA DENATURAZIONE DEL DNA PUO ESSERE INDOTTA CON UN AUMENTO DELLA TEMPERATURA.

12 FIGURA 5.17A STRYER V

13 FIGURA 5.1 GENE VI

14 FIGURA 1.11 REECE, ANALISI GENI E GENOMI

15 EFFETTO SULLA Tm DEL CONTENUTO IN GC E DELLA FORZA IONICA

16 FIGURA 4.17 STRYER IV

17 Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Aumento della forza ionica Stabilizzazione della doppia elica (incremento Tm)

18 Tm = 81,5 + 16,6 (log 10 [Na+]) + 0,41(%GC) QUESTA EQUAZIONE DESCRIVE L EFFETTO DELLA FORZA IONICA E DEL CONTENUTO IN GC SULLA Tm. L EQUAZIONE PUO ESSERE UTILIZZATA PER PREDIRE LA Tm DI UNA MOLECOLA DI DNA.

19 ESERCITAZIONE: PREDIRE LA TEMPERATURA DI FUSIONE DEL DNA GENOMICO UMANO E DI E. COLI AD UNA FORZA IONICA FISIOLOGICA.

20 RINATURAZIONE DEL DNA

21 FIGURA 1.13 GENES VII = 5.2 GENE VI

22 LA VELOCITA DI RINATURAZIONE E INFLUENZATA NOTEVOLMENTE DALLA TEMPERATURA. LA VELOCITA MASSIMA DI RINATURAZIONE SI REALIZZA AD UNA TEMPERATURA DI CIRCA 20 GRADI INFERIORE ALLA Tm (510 GRADI PER OLIGONUCLEOTIDI).

23 PRECIPITAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI CON SALI ED ETANOLO

24 LA PRECIPITAZIONE E ESEGUITA AGGIUNGENDO AL CAMPIONE: ACETATO DI SODIO 0,3 M 2,5 VOLUMI DI ETANOLO

25 Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Aumento della forza ionica Minore repulsione intermolecolare => maggiore tendenza all aggregazione

26 FINALITA : CONCENTRARE L ACIDO NUCLEICO CAMBIARE SOLVENTE SEPARARE L ACIDO NUCLEICO DA NUCLEOTIDI LIBERI

27 ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO

28 L ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO E UNA METODICA PER LA SEPARAZIONE E L ANALISI DI MOLECOLE DI DNA ED RNA SOTTO L INFLUENZA DI UN CAMPO ELETTRICO

29 FIGURA 2.11 REECE, ANALISI GENI E GENOMI L AGAROSIO E UN POLISACCARI DE LINEARE FORMATO DA CIRCA 8000 UNITA DI GALATTOSIO

30 FIGURA 9.2 WILSON (MET. BIOCHIMICA) POZZETTI +

31 FIGURA 2.15 REECE, ANALISI GENI E GENOMI

32 AL TERMINE DELL ELETTROFORESI GLI ACIDI NUCLEICI SONO EVIDENZIATI MEDIANTE TRATTAMENTO CON BROMURO DI ETIDIO.

33 FIGURA 14.8 GENOMI II

34 ECCITATO CON LUCE ULTRAVIOLETTA ( nm) IL BROMURO DI ETIDIO EMETTE LUCE VISIBILE (590 nm). Il LEGAME AL DNA INCREMENTA LA FLUORESCENZA DI 2030 VOLTE.

35 FIGURA P. 37 GENOMI II IL GEL SI OSSERVA AL BUIO

36 ESEMPIO DI ANALISI SU GEL DI AGAROSIO

37 m = k V t d log PM m = MIGRAZIONE ELETTROFORETICA (DISTANZA PERCORSA DA CIASCUNA MOLECOLA AL TERMINE DELL ELETTROFORESI) V = DIFFERENZA DI POTENZIALE ELETTRICO APPLICATA t = DURATA DELLA CORSA ELETTROFORETICA

38 d = DENSITA DI CARICA CIOE RAPPORTO CARICA/MASSA k = COSTANTE DI PROPORZIONALITA TIPICA DEL SISTEMA ELETTROFORETICO UTILIZZATO: DIPENDE DALLA GEOMETRIA DELLA MOLECOLA E DALLA GRANDEZZA DEI PORI DEL GEL

39 NEL CASO DI MOLECOLE DI DNA LINEARI, LA MIGRAZIONE ELETTROFORETICA DIPENDE UNICAMENTE DALLE DIMENSIONI DELLA MOLECOLA, ESSENDO INVERSAMENTE PROPORZIONALE AL LOGARITMO DEL PESO MOLECOLARE (O DEL NUMERO DI BP). NE CONSEGUE CHE LA METODICA PUO ESSERE UTILIZZATA PER DETERMINARE LA LUNGHEZZA DI UNA MOLECOLA DI DNA.

40 FIGURA 2.13 REECE, ANALISI GENI E GENOMI

41 SE SI DISPONE DI UN APPROPRIATO MARCATORE DI PESO MOLECOLARE, LA RETTA DI CALIBRAZIONE PUO ESSERE SUPERFLUA

42 LA MIGRAZIONE ELETTROFORETICA DEI PLASMIDI E INFLUENZATA NOTEVOLMENTE DAL GRADO DI SUPERAVVOLGIMENTO.

43 FIGURE 2.14 E 2.15 WATSON DNA RICOMBINANTE

44 NE CONSEGUE CHE LA TAGLIA MOLECOLARE DI UN PLASMIDE PUO ESSERE STIMATA CON ACCURATEZZA SOLO IN SEGUITO ALLA SUA LINEARIZZAZIONE CON UN ENDONUCLEASI.

45 LA MIGRAZIONE ELETTROFORETICA DEGLI RNA E INFLUENZATA SIA DALLA TAGLIA MOLECOLARE CHE DALLA STRUTTURA SECONDARIA.

46 LE DIMENSIONI DI UNA MOLECOLA DI RNA POSSONO ESSERE STIMATE SOLO OPERANDO L ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI: VIENE AGGIUNTA FORMALDEIDE AL CAMPIONE E AL GEL DI AGAROSIO.

47 LA FORMALDEIDE (HCOH) SI LEGA AI GRUPPI AMMINICI DELLE BASI AZOTATE IMPEDENDO LA RINATURAZIONE DELL RNA

48 SEQUENZIAMENTO DEL DNA IL METODO DI SEQUENZIAMENTO PIU UTILIZZATO E QUELLO DI SANGER, BASATO SULL USO DI DIDEOSSINUCLEOTIDI. IL DNA DA SEQUENZIARE VIENE RICOPIATO IN PRESENZA DI DIDEOSSINUCLEOTIDI 5 TRIFOSFATO CHE AGISCONO COME TERMINATORI DELLA POLIMERIZZAZIONE SEGNALANDO LA POSIZIONE DELLE SINGOLE BASI.

49 FIGURA 6.2 GENOMI II

50 FIGURA 6.7 GENOMI II