cromatografia Elettroforesi
|
|
- Ferdinando Cattaneo
- 7 anni fa
- Visualizzazioni
Transcript
1 Cromatografia ed Elettroforesi Prof.ssa Flavia Frabetti Esplorando le proteine Un passaggio indispensabile negli studi di biochimica che necessitano di conoscere la sequenza aa di una proteina per potere spiegare la sua struttura tridimensionale e dunque il suo funzionamento è la PURIFICAZIONE della proteina di interesse Tre metodi chiave: cromatografia elettroforesi ultracentrifugazione 1
2 CROMATOGRAFIA metodo fisico di separazione dei componenti di una miscela complessa può essere analitica o preparativa di solito per arrivare alla purificazione completa di una sostanza si deve usare una sequenza di più metodi cromatografici il fondamento di tutte le tecniche cromatografiche è il coefficiente di ripartizione (o coefficiente di distribuzione) Kd che descrive come il composto si distribuisce tra due fasi immiscibili. si realizza attraverso l utilizzo di un sistema cromatografico fase stazionaria impaccata in un letto cromatografico fase mobile sistema di distribuzione della fase mobile sistema di rilevazione I singoli componenti di una miscela vengono separati sulla base di differenti CARATTERISTICHE FISICHE: dimensione e forma carica volatilità solubilità affinità di legame per molecole specifiche la separazione dei singoli componenti di una miscela è resa possibile dalla diversa interazione degli stessi con la fase stazionaria interazione forte interazione scarsa ritardo maggiore ritardo minimo tempi di eluizione > tempi di eluizione < 2
3 Lessico scientifico Eluire = lavare via, staccare via, distaccare una sostanza dalla fase stazionare alla quale ha aderito per una specifica affinità Fase = componente del sistema caratterizzato da una uniforme composizione chimica e proprietà fisiche (densità, struttura cristallina, ecc.) miscela fase fase mobile stazionaria rilevatore Si inietta una miscela da analizzare su una colonna I componenti avanzano a diverse velocità attraverso il mezzo di conduzione ovvero la fase mobile, a seconda del grado di affinità per la fase stazionaria, il tempo di uscita verrà registrato dal rilevatore 3
4 Tipologie dei sistemi cromatografici La classificazione può avvenire in base a: forma del letto cromatografico metodo di separazione natura delle fasi mobile o stazionaria Tipologia-classificazione Forma del letto cromatografico es. su strato sottile (es.carta) o su colonna Cromatografia su CARTA colonna contenente la fase stazionaria caricamento campione aggiunta solvente Cromatografia su STRATO SOTTILE raccolta dei componenti 4
5 Tipologia-classificazione Metodo di separazione 1) cromatografia di partizione o ripartizione separazione sulla base della solubilità di molecole piccole ripartizione tra due fasi liquide: acqua che permea una matrice solida inerte + fase mobile organica non polare cromatografia a fase inversa (vedi HPLC) matrice inerte di supporto fase stazionaria liquida molecole non polari che si sciolgono nella fase stazionaria flusso della fase mobile molecole polari che passano velocemente attraverso la colonna Metodo di separazione 2) cromatografia per gel permeazione (o esclusione molecolare) separazione sulla base della dimensione fase stazionaria = granuli porosi di un polimero insolubile ma molto idratato molecole piccole che hanno accesso all intera matrice molecole medie che hanno accesso solo ai pori più larghi fase stazionaria gel microporoso molecole grandi che sono totalmente escluse dai pori e passano rapidamente attraverso la colonna flusso della fase mobile 5
6 Metodo di separazione 3) cromatografia a scambio ionico separazione sulla base della carica fase stazionaria = colonne con resine: cariche + (es.dietilamminoetil-cellulosa o DEAE-cellulosa) oppure cariche - (es.carbossimetil-cellulosa o CM-cellulosa) fase stazionaria resina a scambio cationico + + _ flusso della fase mobile - - cationi (+) del campione che vengono trattenuti dalla colonna Separazione di aa in una colonna a scambio cationico Colonna a scambio cationico Asp Ser Lys 6
7 Metodo di separazione 4) cromatografia per affinità separazione sulla base ad una affinità chimica di legame fase stazionaria = colonne dove viene immobilizzato un ligando specifico per una certa molecola che ha una struttura complementare che specificamente riconosce quel ligando fase stazionaria: matrice solida di supporto tratto spaziatore ligando molecola complementare legata da interazioni specifiche al ligando flusso della fase mobile tutti gli altri soluti vengono eluiti Tipologia-classificazione fase stazionaria: solido/gel o liquido Natura delle fasi mobile o stazionaria fase mobile: liquido o gas Tipo es. Gascromatografia Cromatografia liquida (LC) Cromatografia su strato sottile (TLC) Cromatografia a Scambio ionico (IEC) Fase stazionaria Solida o liquida solida solida solida Fase mobile gas liquida liquida liquida 7
8 Tipologia-classificazione fase stazionaria: solido/gel o liquido Natura delle fasi mobile o stazionaria esempi: fase mobile: liquido o gas cromatografia liquida-liquida: HPLC cromatografia ad alta performance o cromatografia liquida ad alta pressione pompa rilevatore colonna Fase stazionaria solida cromatografia gas -liquida: gas-cromatografia carrier gas Esempio di un cromatogramma Deve avere una buona risoluzione 8
9 t R2 t M t R1 Δt inizio picco di un soluto non trattenuto W b1 W b2 t R = tempo di ritenzione t M = tempo di ritardo della fase mobile t R1 = t R -t M Δt = distanza tra i 2 picchi RISOLUZIONE R= Δt W b1 +W b2 2 se R = 1.5 separazione completa ELETTORFORESI metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico si realizza attraverso l utilizzo di un sistema elettroforetico matrice di gel cella elettroforetica alimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante) tamponi salini si possono studiare sia gli acidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine 9
10 Matrice di gel serve da setaccio molecolare e consente la separazione Come si forma il gel? può essere fatto di polimeri agarosio o poliacrilamide Gel di agarosio: pesare l agarosio misurare il buffer (TBE/TAE) bollire l agarosio in buffer versare il gel nella vaschetta allestita Gel di acrilamide: miscelando acrilamide e bis-acrilamide che formano un polimero complesso a maglia* Gel di acrilamide utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine di solito in sistemi verticali la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende principalmente da 4 parametri taglia molecolare del peptide concentrazione di acrilamide conformazione della molecola (denaturata o meno) voltaggio 10
11 Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteine è di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistema verticale SDS = detergente (sodio-dodecil-solfato) carico - catodo anodo supporto di plastica campione pozzetti con i campioni tampone tampone DENATURAZIONE DELLE PROTEINE bollitura proteina tetramerica proteina monomerica SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico) BME = β- mercaptoetanolo (riducente) bollitura peptidi connessi da ponti disolfuro peptidi separati 11
12 Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi (in kilodalton) ph basico II fase: separazione dimensionale I fase: sep. x carica ph acido ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE SU GEL o ISOELECTROFOCUSING punto isoelettrico (pi): il ph al quale la carica netta di una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, qui La proteina non sarà più soggetta a migrazione elettroforetica Dal Chieffi riquadro 2.2 pag:
13 Rivelazione della separazione elettroforetica: tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela (es. con comassie blue o silver-stain) trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici attraverso la tecnica del Western Blotting per analisi più fini, specifiche 1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi 2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici 1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare il turn-over proteico. L isotopo radioattivo più usato è lo zolfo 35 S 2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici consente di riconoscere una specifica proteina di interesse consta di diverse fasi schematizzabili in: a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa b) rivelazione con l anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) 13
14 a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa trasferimento delle proteine carta imbevuta di tampone carta imbevuta di tampone proteina di interesse b) rivelazione con l anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) - fasi procedurali la membrana viene saturata da proteine inerti anticorpi I legano l antigene anticorpi II legano gli anticorpi I sviluppo della colorazione enzimatica 14
15 Stima della dimensione di una molecola in rapporto alla mobilità elettroforetica di std di dimensione nota (questo vale anche per le proteine) Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi (in kilodalton) Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine
Elettroforesi proteine ed acidi nucleici
Elettroforesi proteine ed acidi nucleici Flavia Frabetti Tecnici di laboratorio 2010/2011 ELETTORFORESI metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte
DettagliTECNICHE DI SEPARAZIONE DELLE PROTEINE Le proteine sono purificate con procedure di frazionamento
TECNICHE DI SEPARAZIONE DELLE PROTEINE Le proteine sono purificate con procedure di frazionamento Eliminazione selettiva di tutti gli altri componenti della miscela alla fine resta soltanto la sostanza
DettagliTECNICHE CROMATOGRAFICHE
TECNICHE CROMATOGRAFICHE Le tecniche cromatografiche permettono di separare gli analiti presenti in una miscela complessa. Tutti i sistemi cromatografici sono costituiti da una fase stazionaria, che puo
DettagliTIPI DI CROMATOGRAFIE
Corso di Chimica Analitica TIPI DI CROMATOGRAFIE Prof. Paola Gramatica Fasi in successione: 2) Separazione dei componenti la miscela Dopo l isolamento della miscela da analizzare, se ne devono separare
Dettagli2. LA PURIFICAZIONE DI PROTEINE:
2. LA PURIFICAZIONE DI PROTEINE: LA CROMATOGRAFIA Corso 240/350: Didattica di biochimica e biologia molecolare con laboratorio (2 CFU-16 ore) Marco Scocchi ( BIO/10-11) LA PURIFICAZIONE DI PROTEINE Purificare
DettagliGENERALITA SULLA CROMATOGRAFIA
GENERALITA SULLA CROMATOGRAFIA COSA SONO LE TECNICHE CROMATOGRAFICHE? La cromatografia consiste nello sfruttare la diversa attitudine di ogni molecola o ione nel distribuirsi fra 2 fasi differenti. Una
DettagliTIPI di CROMATOGRAFIA
Metodo di separazione che si basa sulla distribuzione degli analiti tra una fase mobile e una fase stazionaria. TIPI di CROMATOGRAFIA Eluizione degli analiti può avvenire: Capillarità Gravità Pressione
DettagliTECNICHE CROMATOGRAFICHE
TECNICHE CROMATOGRAFICHE ISOLAMENTO DI MOLECOLE BIOLOGICHE Distruzione delle cellule e dei tessuti che contengono le molecole biologiche di nostro interesse (proteine o acidi nucleici) -Tampone (ph) -Sali
Dettagli3. ELETTROFORESI DI PROTEINE
3. ELETTROFORESI DI PROTEINE Corso 240/350: Didattica di biochimica e biologia molecolare con laboratorio (2 CFU-16 ore) Marco Scocchi ( BIO/10-11) ELETTROFORESI PRINCIPI GENERALI Migrazione di particelle
DettagliAnalisi e purificazione di proteine
Analisi e purificazione di proteine elettroforesi ultracentrifugazione cromatografia frammenti specifici sequenziamento struttura primaria livelli superiori contesto fisiologico funzione Condizioni denaturanti
DettagliCromatografia Dal greco chroma : colore, graphein : scrivere 1903 Mikhail Twsett (pigmenti vegetali su carta)
Cromatografia Dal greco chroma : colore, graphein : scrivere 1903 Mikhail Twsett (pigmenti vegetali su carta) E il termine generico che indica una serie di tecniche di separazione di molecole simili in
DettagliAnalisi e purificazione di proteine
Analisi e purificazione di proteine elettroforesi ultracentrifugazione cromatografia frammenti specifici sequenziamento struttura primaria contesto fisiologico livelli superiori funzione Elettrofores i
DettagliElettroforesi di Tamara Benincasa
Elettroforesi di Tamara Benincasa L elettroforesi è una metodologia utilizzata in laboratorio attraverso la quale molecole biologiche (ammino acidi, peptidi, proteine, nucleotidi ed acidi nucleici), dotate
DettagliTECNICHE CROMATOGRAFICHE
TECNICHE CROMATOGRAFICHE Cromatografia è il termine generico che indica una serie di tecniche di separazione di molecole simili in base alle loro proprietà chimiche e fisiche. Questo metodo di separazione
DettagliMetodi di studio delle proteine :
Metodi di studio delle proteine : determinazione della quantità determinazione della struttura primaria (sequenza a.a.) determinazione della struttura 3D determinazione del peso molecolare Spettrofotometro
DettagliTECNICHE ELETTROFORETICHE
TECNICHE ELETTROFORETICHE L elettroforesi e un metodo di separazione che si basa sulla diversa mobilita degli ioni (o di sostanze elettricamente cariche), quando posti all interno di un campo elettrico
DettagliWESTERN BLOT o IMMUNOFISSAZIONE
WESTERN BLOT o IMMUNOFISSAZIONE BLOTTING Trasferimento di macromolecole su una membrana immobilizzante. Southern DNA - da Edward Southern 1970 Northern Western RNA Proteine SCOPO DEL WESTERN BLOTTING Consente
DettagliCorso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA
Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Lezione 13 Cromatografia ed elettroforesi Concetti chiave: Il comportamento cromatografico di una proteina è influenzato da alcune
DettagliGenomica e Proteomica
Genomica e Proteomica Genomica: sequenziamento del DNA presente in un organismo e analisi dei geni (bioinformatica) Proteomica: analisi delle proteine di un organismo: Quali proteine in un dato momento
DettagliElettroforesi. Elettroforesi: processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita.
Elettroforesi Elettroforesi: processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita. A qualunque ph diverso dal pi le proteine hanno una carica netta quindi,
DettagliLa titolazione è un metodo di analisi chimica per la misura della concentrazione di una data sostanza in soluzione.
Tecniche di analisi chimica Prof. Marcello Romagnoli Titolazione La titolazione è un metodo di analisi chimica per la misura della concentrazione di una data sostanza in soluzione. Una quantità nota del
DettagliELETTROFORESI DI PROTEINE
ELETTROFORESI DI PROTEINE Molto più complessa della separazione elettroforetica di DNA. forma delle proteine fortissime variazioni cariche delle proteine La > parte dei campioni di PROTEINE è più piccola
DettagliSolida. una fase fissa (o stazionaria) Liquida. una fase mobile che la attraversa con un flusso continuo e provoca la migrazione dei soluti.
TECNICHE CROMATOGRAFICHE insieme di tecniche che permettono di separare i soluti contenuti in un miscuglio omogeneo in base alla loro diversa distribuzione fra due fasi immiscibili: una fase fissa (o stazionaria)
DettagliEstrazione con solvente 18/01/2010. Laboratorio di chimica. Prof. Aurelio Trevisi
Laboratorio di chimica Prof. Aurelio Trevisi Estrazione con solvente SCOPO: Estrarre mediante cicloesano lo iodio da una soluzione idroalcolica L estrazione con solventi si basa sulla diversa affinità
Dettagliε 340 nm A 260 nm A 260nm = 1.36 A 340 nm = A 340nm A = c [NADH] = : 6.22 x 10 3 = x 10-6 M
ESERCIZI 2 Esercizio n.1 Trovare la concentrazione di NAD e NADH in una soluzione miscelata basandosi sui seguenti dati ottenuti in una cuvetta da 1 cm : I coefficienti di estinzione molare a 260 nm sono
DettagliMETODICHE DI IMMUNOCHIMICA
METODICHE DI IMMUNOCHIMICA IMMUNOCHIMICA permette la determinazione quantitativa di proteine in tessuti e omogenati INTERAZIONI ANTIGENE-ANTICORPO L immunochimica si basa sulle interazioni antigene-anticorpo
DettagliBiochimica delle proteine Prof. M. Bolognesi a.a. 2007/2008. Eloise Mastrangelo
Biochimica delle proteine Prof. M. Bolognesi a.a. 2007/2008 Eloise Mastrangelo Perché è importante determinare la struttura primaria delle proteine? 1. La conoscenza della sequenza amminoacidica delle
DettagliCromatografia di scambio ionico su colonna
S.A.G.T. Anno Accademico 2009/2010 Laboratorio Ambientale II A Dottoressa Valentina Gianotti Marco Soda Matricola num. 10015062 Cromatografia di scambio ionico su colonna La cromatografia è un metodo di
DettagliEstrazione con solventi. Dott.ssa Laura Casu Laurea in chimica e tecnologie farmaceutiche 9 crediti
Estrazione con solventi Dott.ssa Laura Casu Laurea in chimica e tecnologie farmaceutiche 9 crediti Estrazione in Soxhlet Vantaggi: Estrazione in continuo Refrigerante Svantaggi: richiede molte ore (12/24)
DettagliESTRAZIONE PURIFICAZIONE. Modificazione chimica ANALISI STRUMENTALE
Procedura per l analisi quali/quantitativa. Analita puro Composto di riferimento Curva di calibrazione Singolo-Più punti Campione biologico ESTRAZIONE PURIFICAZIONE Modificazione chimica ANALISI STRUMENTALE
DettagliGASCROMATOGRAFIA INTRODUZIONE
GASCROMATOGRAFIA INTRODUZIONE La Gascromatografia è una tecnica analitica utile per separare componenti o soluti di una miscela, sulla base delle quantità relative di ogni soluto, distribuite fra un carrier
DettagliL elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche.
L elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche. L elettroforesi è una tecnica che viene usata per separare molecole
DettagliMETODI DI BASE PER L ANALISI DEGLI ACIDI NUCLEICI
METODI DI BASE PER L ANALISI DEGLI ACIDI NUCLEICI SPETTRI UV E QUANTIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DEGLI ACIDI NUCLEICI FIGURA 7.6A METODOLOGIA BIOCHIMICA (WILSON) a a = a 1 Assorbimento = a b a 1 b FIGURA
DettagliProf. Maria Nicola GADALETA
Prof. Maria Nicola GADALETA E-mail: m.n.gadaleta@biologia.uniba.it Facoltà di Scienze Biotecnologiche Corso di Laurea in Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche Biochimica e Biotecnologie Biochimiche DISPENSA
Dettagli2. Tecniche immunochimiche: Western blotting; ELISA; sandwich ELISA 3. Tecniche spettroscopiche: spettrofotometria UV/vis; spettrofluorimetria
1. Tecniche elettroforetiche: SDS-PAGE 2. Tecniche immunochimiche: Western blotting; ELISA; sandwich ELISA 3. Tecniche spettroscopiche: spettrofotometria UV/vis; spettrofluorimetria Testo consigliato Keith
DettagliIn laboratorio si devono osservare delle norme necessarie ad evitare incidenti che talvolta possono rivelarsi estremamente pericolosi.
In laboratorio si devono osservare delle norme necessarie ad evitare incidenti che talvolta possono rivelarsi estremamente pericolosi. 1. E ovviamente vietato fumare. 2. Non distrarsi in nessun caso, nè
DettagliIL PROBLEMA ANALITICO
IL PROBLEMA ANALITICO COSA CERCARE? COME TROVARLO? 1. TRATTAMENTO CAMPIONE 2. ESTRAZIONE 3. PURIFICAZIONE 4. DETERMINAZIONE QUALI-QUANTITATIVA STORIA Cromatografia = colore + grafia 1906 Michael Tswett,
Dettagli2. SISTEMA DI PURIFICAZIONE CROMATOGRAFICA A MEDIA PRESSIONE (Biotage).
1. APPARECCHIO PER REAZIONI A MICROONDE (Cem). Apparecchio per reazioni a microonde con sistema di sfiato automatico delle sovrappressioni, che consente di condurre reazioni che superano i 300 psi (20
DettagliLABORATORIO DI CHIMICA II
LABORATORIO DI CHIMICA II Docente Prof. A. Nacci Testo cons. Il laboratorio di Chimica Autori Editore Consiglio Frenna Orecchio EdiSES TECNICHE DI SEPARAZIONE E PURIFICAZIONE 22 TECNICA DECANTAZIONE FILTRAZIONE
DettagliEsercitazione 4: determinazione della concentrazione di sodio e potassio nelle urine mediante spettroscopia di emissione in fiamma
Esercitazione 4: determinazione della concentrazione di sodio e potassio nelle urine mediante spettroscopia di emissione in fiamma Apparato strumentale Sodio e potassio vengono determinati in campioni
DettagliAmminoacidi. Struttura base di un a-amminoacido
Amminoacidi Struttura base di un a-amminoacido Forma non ionizzata Forma ionizzata, sale interno (zwitterione) Il carbonio α di tutti gli α-amminoacidi (tranne la glicina) è asimmetrico (=chirale) D-alanina
Dettaglila purificazione può essere di tipo analitico o preparativo Purificare una proteina significa ottenerla in forma omogenea
la purificazione può essere di tipo analitico o preparativo Purificare una proteina significa ottenerla in forma omogenea Analisi delle sue proprietà fisiche e biologiche Come viene modulata la sua espressione
DettagliAnalisi di proteine:
Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot Seminario Metodologico per il Corso di Didattica Libera Marilena Dinardo mariamaddalena.dinardo@uniba.it Le proteine sono il prodotto dei geni: sono le
DettagliCORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA GENERALE E APPLICATA Anno Accademico 2006/2007. Corso di: Laboratorio di Biologia II Chimica Biologica
CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA GENERALE E APPLICATA Anno Accademico 2006/2007 Corso di: Laboratorio di Biologia II Chimica Biologica Dott. Marcello MEROLA Parziale purificazione dell enzima Alcool Deidrogenasi
DettagliELETTROFORESI. Tecnica analitica che consente di separare molecole cariche grazie all applicazione di un campo elettrico.
ELETTROFORESI ELETTROFORESI Tecnica analitica che consente di separare molecole cariche grazie all applicazione di un campo elettrico. Anioni ANODO (+) Cationi CATODO (-) v = velocità di migrazione μ =
DettagliLa fase stazionaria è generalmente immobilizzata su di una matrice inerte quale agarosio, cellulosa, destrano, poliacrilammide, silice.
Cromatografia La cromatografia è una tecnica di migrazione differenziata mediante la quale si possono separare analiti affini presenti in una miscela In ogni tipo di cromatografia si identificano : Una
DettagliMetodologie citogenetiche. Metodologie molecolari. Formulare la domanda Utilizzare la metodica appropriata
In base al potere di risoluzione della tecnica Metodologie citogenetiche Metodologie molecolari Formulare la domanda Utilizzare la metodica appropriata 1 DNA RNA PROTEINE DNA Cromosomi (cariotipo, FISH,
DettagliCROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)
CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) La fase stazionaria riveste con uno strato sottile una lastrina di vetro o alluminio La lastrina viene disposta verticalmente in un recipiente chiuso ermeticamente
DettagliGas-cromatografia. onna.
Gas-cromatografia La fase mobile è un gas. Le sostanze da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere portate ad una temperatura sufficiente a renderle gassose o comunque portarle allo stato di vapore.
DettagliELETTROFORESI. Tecnica analitica che consente di separare molecole cariche grazie all applicazione di un campo elettrico.
ELETTROFORESI ELETTROFORESI Tecnica analitica che consente di separare molecole cariche grazie all applicazione di un campo elettrico. Anioni ANODO (+) Cationi CATODO (-) v = velocità di migrazione μ =
DettagliCORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA GENERALE E APPLICATA
CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA GENERALE E APPLICATA Curriculum Biologia della Nutrizione Anno Accademico 2012/2013 Corso di Chimica Biologica e laboratorio Dott. Eliodoro Pizzo Materiale Didattico Laboratorio
DettagliCromatografia ionica (IC)
Cromatografia ionica (IC) Il principio di base della cromatografia ionica è lo scambio ionico su resine scambiatrici forti, che costituiscono la fase stazionaria con cui sono impaccate le colonne, in parziale
DettagliLUMINESCENZA. semiconduttore
LUMINESCENZA LUMINESCENZA Elettroluminescenza Radioluminescenza Chemiluminescenza Bioluminescenza Termoluminescenza Triboluminescenza Sonoluminescenza Fotoluminescenza corrente elettrica in gas ionizzato
DettagliElettroforesi - ++ In assenza di moti diffusivi/convettivi gli analiti neutri non possono spostarsi nel mezzo.
Elettroforesi Con il termine elettroforesi si indica una famiglia di tecniche in cui la separazione di analiti viene effettuata sfruttandone la diversa migrazione sotto l azione di un campo elettrico:
DettagliLa cromatografia di adsorbimento
La cromatografia di adsorbimento Cromatografia: serie di tecniche di separazione per scopi analitici e preparativi Tutte le tecniche cromatografiche operano sul principio che i componenti di una miscela
DettagliISIS A PONTI Gallarate
4 A TCB 1 IL CROMATOGRAMMA: E il tracciato che descrive l andamento del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente a partire dall istante in cui la miscela viene introdotta nella
DettagliMETODICHE NEL LABORATORIO CHIMICO-CLINICO
METODICHE NEL LABORATORIO CHIMICO-CLINICO SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO TURBIDIMETRIA/NEFELOMETRIA FLUORIMETRIA SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO FOTOMETRIA DI EMISSIONE A FIAMMA RIFLETTANZA
DettagliIl ruolo del T.S.R.M. nella U.O. Ciclotrone
Il ruolo del T.S.R.M. nella U.O. Ciclotrone TSRM G.Bigi- CTSRM P.Sangalli- TSRM S.Cola Dott. D.Salvo- Dott. A.Versari- Dott. D.Serafini Dott. M.Asti-Dott. F.Fioroni*- Dott. E.Grassi* Arcispedale Santa
DettagliSolventi (eluenti) per cromatografia :)"#$#%#*1#5"#%+!()*/$'"=%3.$#-.#5"#
Solventi (eluenti) per cromatografia!"#$#%&'%(#"$)*')%+,'-.#*/%&'%'&$)./$01$'%/%0/--)%(2#23 4'.*)#-/5) 6#"$/.*)$1$)%&'%./$0)5') 6)*1#5# 4*)$)7)$,') 8'.*)$),#"/5) 8'#"'*%#"#$#!"'*#%/.#"/") 9.#")5# :'$'&'5/!"/5)*)
DettagliPolymerase chain reaction - PCR. Biotecnologie applicate all ispezione degli alimenti di origine animale
Prof.ssa Tiziana Pepe Polymerase chain reaction - PCR Biotecnologie applicate all ispezione degli alimenti di origine animale Dip. di Medicina Veterinaria e Produzioni animali tiziana.pepe@unina.it Metodologia
DettagliMETODI BIOCHIMICI ESERCIZI D ESAME (by NewSgrunt)
METODI BIOCHIMICI ESERCIZI D ESAME 2002 2006 (by NewSgrunt) A) SPETTROSCOPIA UV/vis, LAMBERT-BEER, STUDIO DELLE PROTEINE 1A) Il Citocromo c è caratterizzato dai seguenti coefficienti di estinzione molare:
Dettagli1. Cromatografia per gel-filtrazione
1. Cromatografia per gel-filtrazione La gel filtrazione è un metodo cromatografico che separa le sostanze in base alle loro dimensioni molecolari. I materiali che costituiscono il supporto per la gel-filtrazione
DettagliNever impure protein PURIFICAZIONE DI PROTEINE
Never waste pure thoughts on an impure protein PURIFICAZIONE DI PROTEINE PURIFICARE Purificare significa ottenere solamente la nostra molecola di interesse. Purificare una proteina per: Determinarne la
DettagliSouthern blot. !Per. determinare la presenza o assenza di specifici frammenti genici. !Studio. della struttura e dell organizzazione di un gene
Southern blot!per determinare la presenza o assenza di di specifici frammenti genici!studio della struttura e dell organizzazione di di un gene Southern blot Procedura Isolare DNA genomico Digerirlo con
Dettagliestrazione e poi una separazione, con una (TLC) di pg pigmenti (clorofille, caroteni ) estratto di foglie di spinaci o di fili d erba.
Pigmenti da spinaci o foglie verdi In questa esperienza si effettuerà una estrazione e poi una separazione, con una cromatografia di adsorbimento in strato t sottile (TLC) di pg pigmenti (clorofille, caroteni
DettagliAMPICILLINA SODICA PREPARAZIONE INIETTABILE. Ampicillina sodica polvere sterile per preparazioni iniettabili
1 0 1 0 1 0 1 0 1 001/FU Aprile 00 Commenti entro il Settembre 00 NOTA: Armonizzata con la versione revisionata della B.P. La monografia è stata completamente revisionata per armonizzarla con le corrispondenti
DettagliREGISTRO DELLE LEZIONI 2005/2006. Tipologia. Addì Tipologia. Addì Tipologia
Presentazione del corso. Modalità di svolgimento della prova di esame. Introduzione all'analisi organica qualitativa. Analisi organica qualitativa: comportamento alla calcinazione. Saggio di Laissagne
DettagliCOS E LA PROTEOMICA? The total PROTEIN complement of a GENOME Proteoma proteine codificate modificazioni post-traduzionali
COS E LA PROTEOMICA? The total PROTEIN complement of a GENOME (M. Wilkins et al. Electrophoresis 1995,16 1090-95) La Proteomica è lo studio del PROTEOMA Ud'A [Biochimica Applicata 1] dia n. 1 Proteoma
DettagliSchema a blocchi di uno spettrofluorimetro
MONOCROMATORE EMISSIONE EM Schema a blocchi di uno spettrofluorimetro MONOCROMATORE ECCITAZIONE SORGENTE EXC RIVELATORE (TUBO FOTOMOLTIPLICATORE) Anche il DNA assorbe nell UV Cosa determina l assorbanza
DettagliLE PROTEINE. SONO Polimeri formati dall unione di AMMINOACIDI (AA) Rende diversi i 20 AA l uno dall altro UN ATOMO DI C AL CENTRO
LE PROTEINE SONO Polimeri formati dall unione di ATOMI DI C, H, N, O CHE SONO AMMINOACIDI (AA) Uniti tra loro dal Legame peptidico 20 TIPI DIVERSI MA HANNO STESSA STRUTTURA GENERALE CON Catene peptidiche
DettagliEsercitazioni di Elementi di Chimica. Modulo 3 Trasformazioni della Materia
Esercitazioni di Elementi di Chimica Modulo 3 Trasformazioni della Materia Esempi di quiz a risposta multipla e questionari a completamento L esame finale sarà composto da problemi simili Quale/i dei seguenti
Dettagli- determinazione colorimetrica della concentrazione di una miscela proteica
CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA GENERALE E APPLICATA Anno Accademico 2013/2014 Laboratorio di Chimica Biologica - Cromatografia a scambio ionico - determinazione colorimetrica della concentrazione di una miscela
DettagliIsolamento di molecole e cellule Biglie magnetiche N Diametro (µm)
Dynabeads Isolamento di molecole e cellule Biglie magnetiche N Diametro (µm) Isolamento di molecole Dynabeads Biglie magnetiche con differenti gruppi chimici sulla superficie, adatti per legarvi diverse
DettagliSostanze non volatili possono essere derivatizzate
Gascromatografia Permette la separazione di sostanze gassose o gassificabili variando la temperatura. Sono sostanze a basso peso molecolare, di natura poco polare, assolutamente non ionica. Eventualmente
DettagliPrincipali tecniche di cromatografia per la separazione delle proteine
Principali tecniche di cromatografia per la separazione delle proteine Gel filtrazione Interazioni idrofobiche Scambio ionico Affinità La cromatografia è un metodo di separazione che si basa sulla differente
DettagliAmministrazione, finanza e marketing - Turismo Ministero dell Istruzione, dell Università e della Ricerca PROGRAMMAZIONE DISCIPLINARE PER U. di A.
MATERIA CHIMICA CLASSE 2 INDIRIZZO AFM / TUR DESCRIZIONE Unità di Apprendimento UdA n. 1 Titolo: LA MATERIA Aver acquisito la capacità di osservare, descrivere ed analizzare i fenomeni legati alle trasformazioni
DettagliLa frazione lipidica TRIGLICERIDI
Dott. Raffaele Marrone raffaele.marrone@unina.it La frazione lipidica TRIGLICERIDI 1 TRANSESTERIFICAZIONE reazione di sostituzione nucleofila GAS CROMATOGRAFIA La tecnica cromatografica consiste nello
DettagliBiologia Molecolare. CDLM in CTF La trascrizione negli eucarioti
Biologia Molecolare CDLM in CTF 2010-2011 La trascrizione negli eucarioti I meccanismi della trascrizione Organizzazione generale delle sequenze regolative Il macchinario generale della trascrizione Si
Dettagli1. Considerazioni generali
1. Considerazioni generali La cromatografia di scambio ionico IEC (Ionic Exchange Chromatography) consente di separare i componenti di una miscela a condizione che si trovino in forma ionica, come cationi
DettagliDistillazione + Separazione con Membrane Distillazione + Adsorbimento
Distillazione + Separazione con Membrane Distillazione + Adsorbimento Membrana Barriera semipermeabile tra due fasi che separa i composti a diversa permeabilità ermeato => frazione che passa attraverso
DettagliI RECETTORI: Caratterizzazione e isolamento
I RECETTORI: Caratterizzazione e isolamento Andrea Ferrigno Funzione dei recettori di membrana Secrezione dell ormone nel sangue L ormone è trasportato attraverso il circolo sanguigno L ormone raggiunge
DettagliH.P.L.C. High Performance Liquid Chromatography
Lezione 16 14.12.2015 H.P.L.C. High Performance Liquid Chromatography cromatografia liquida fase mobile allo stato liquido strumento costituito da: 1) riserva di fase mobile 2) filtro 3) sistema di pompaggio
DettagliPerche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine?
Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? I gel di poliacrilammide hanno una trama piu compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu piccole
Dettagli- determinazione colorimetrica della concentrazione di una miscela proteica. - Determinazione spettrofotometrica dell attività enzimatica
CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA GENERALE E APPLICATA Anno Accademico 2012/2013 Laboratorio di Chimica Biologica - Cromatografia a scambio ionico - determinazione colorimetrica della concentrazione di una miscela
DettagliColonne Agilent AdvanceBio SEC per l'analisi di aggregati: compatibilità degli strumenti
Colonne Agilent AdvanceBio SEC per l'analisi di aggregati: compatibilità degli strumenti Caratteristiche tecniche Introduzione Le colonne AdvanceBio SEC di Agilent sono una nuova famiglia di colonne per
Dettaglideterminazione della quantità determinazione della struttura primaria (sequenza a.a.) determinazione della struttura 3D
Metodi di studio delle proteine : determinazione della quantità determinazione della struttura primaria (sequenza a.a.) determinazione della struttura 3D Spettrofotometro cuvetta monocromatore rivelatore
DettagliI vantaggi delle colonne Agilent AdvanceBio SEC per le analisi biofarmaceutiche
I vantaggi delle colonne Agilent AdvanceBio SEC per le analisi biofarmaceutiche Confronto tra le colonne di diversi fornitori per una migliore qualità dei dati Caratteristiche tecniche Introduzione La
Dettaglile porzioni con strutture secondarie sono avvicinate e impaccate mediante anse e curve della catena. STRUTTURA TERZIARIA
STRUTTURA TERZIARIA le porzioni con strutture secondarie sono avvicinate e impaccate mediante anse e curve della catena. Le proteine globulari dopo aver organizzato il proprio scheletro polipeptidico con
DettagliCHIMICA ANALITICA II CON LABORATORIO. (AA ) 8 C.F.U. - Laurea triennale in Chimica
CHIMICA ANALITICA II CON LABORATORIO (AA 2016-17) 8 C.F.U. - Laurea triennale in Chimica 10 Fondamenti teorici / cromatografia su colonna Lo sviluppo di un cromatogramma Tecnica di eluizione (eluente è
DettagliElettroforesi. Migrazione di particelle cariche sotto l influenza di un campo elettrico
Migrazione di particelle cariche sotto l influenza di un campo elettrico La velocità di una molecola carica che si muove in un campo elettrico è direttamente proporzionale alla forza del campo elettrico
DettagliCROMATOGRAFIA SU COLONNA
1 CROMATOGRAFIA SU COLONNA La cromatografia è una tecnica di migrazione differenziata che permette la separazione dei costituenti di una miscela di sostanze affini. La cromatografia può essere di tipo
DettagliMetodi di studio delle proteine (o altre macromolecole)
Metodi di studio delle proteine (o altre macromolecole) Purificazione Separazione da altri componenti cellulari; determinazione del grado di purezza Studio Determinazione della struttura funzione regolazione
DettagliL approccio analitico
L approccio analitico la sequenza analitica Estrazione della frazione aromatica Introduzione in un sistema cromatografico Separazione dei composti dell aroma Riconoscimento e quantificazione L approccio
Dettagli8-06-2010. BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING. BLOTTING delle proteine: NORTHERN BLOTTING SOUTHERN BLOTTING
8-06-2010 TECNICHE PER L ANALISI DELL ESPRESSIONE GENICA BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR REAL TIME PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING BLOTTING delle proteine: MICROARRAYS MACROARRAYS
DettagliAmminoacidi Peptidi Proteine
Amminoacidi Peptidi Proteine Amminoacidi-Peptidi-Proteine Amminoacidi: Struttura generale COOH H NH 2 Centro chiralico Stereoisomeri: composti con la stessa connessione tra gli atomi, ma con una differente
DettagliIl latte, una fonte di nutrimento per tutti i mammiferi, contiene numerose proteine.
Il latte, una fonte di nutrimento per tutti i mammiferi, contiene numerose proteine. Centrifugazione differenziale Le cellule vengono distrutte in un omogenizzatore e la miscela che ne deriva (omogenato),
DettagliElettroforesi su gel. L elettroforesi è definita come la migrazione di particelle sotto l influenza di un campo elettrico.
Elettroforesi su gel L elettroforesi è definita come la migrazione di particelle sotto l influenza di un campo elettrico. La mobilità della particella dipende dalla forza elettrostatica netta che agisce
DettagliESTRAZIONE CON SOLVENTE
ESTRAZIONE CON SOLVENTE TECNICA DI SEPARAZIONE BASATA SUL TRASFERIMENTO SELETTIVO DI UNO O PIÙ COMPONENTI DI UNA MISCELA SOLIDA, LIQUIDA O GASSOSA DA UN SOLVENTE AD UN ALTRO SOLVENTE IMMISCIBILE CON IL
DettagliMolti ceramici sono sempre più utilizzati nel settore dell elettrotecnica e dell elettronica. La conducibilità di tipo elettronica o ionica può
Molti ceramici sono sempre più utilizzati nel settore dell elettrotecnica e dell elettronica. La conducibilità di tipo elettronica o ionica può essere molto variabile a seconda della composizione: si passa
DettagliTecniche elettroforetiche. Applicazione: Proteolisi limitata
Tecniche elettroforetiche Applicazione: Proteolisi limitata PRINCIPI GENERALI Elettroforesi: Migrazione di particelle cariche sotto l azione di un campo elettrico Il campo elettrico è generato applicando
Dettagli