ISIS A PONTI Gallarate
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- Lamberto Santoro
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1 4 A TCB 1 IL CROMATOGRAMMA: E il tracciato che descrive l andamento del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente a partire dall istante in cui la miscela viene introdotta nella colonna. Al passaggio del solo eluente (o del gas di trasporto carrier ) il segnale è bassissimo, quindi avremo la linea di base. Al passaggio delle sostanze in esame il segnale amplificato ed il tracciato si inclina, raggiunge un massimo e ritorna alla linea di base. Ognuno di questi è detto picco cromatografico. Il suo andamento in condizioni ideali è quello di una Gaussiana. h: l altezza del picco, indica la distanza fra il punto di massimo e la tangente alla linea di base. Wb : larghezza del picco: è uguale alla lunghezza delle due tangenti ai punti di flesso. Wh : larghezza a metà altezza, è uguale alla larghezza a metà altezza del picco (50% altezza). A: indica l area totale ed è proporzionale alla concentrazione o quantità di sostanza separata. L area ABCDE corrisponde a circa il 95 % dell area del picco. T R (tempo di ritenzione): è il tempo impiegato da ciascuna sostanza per scorrere nella colonna (dall iniezione al punto di max) V R : volume di ritenzione questo valore si può misurare ed è tipico di ogni sostanza. 1
2 4 A TCB 2 Con T M indichiamo il tempo morto : corrisponde al tempo di ritenzione di una sostanza che non viene trattenuta dalla fase stazionaria. Il tempo di contatto di ogni Sostanza con la fase stazionaria è detto tempo di ritenzione corretto. T 1 R= T R -T M Il volume corretto V 1 R=V R -V M Se consideriamo il flusso della fase mobile costante tra V e T esiste una relazione V R =T R x F C V 1 R=T 1 R x F C F C = al flusso del carrier in Gc (ml/min). t R t M COSTANTE DI DISTRIBUZIONE: durante il passaggio delle sostanze nella colonna si stabilisce un equilibrio fra fase mobile e stazionaria, se indichiamo con C la concentrazione avremo: C M C S cui corrisponde una costante di equilibrio detto anche coefficiente di distribuzione. K C = C S /C M K C dipende dalla natura della fase mobile e stazionaria ma anche dalla temperatura di lavoro (è una grandezza termodinamica). Se K C è grande, significa che C s C M quindi la sostanza è molto affine con la fase stazionaria. Quindi il V R = V M +V X dove V X è il volume di fase mobile in più rispetto a V M necessario a far uscire la sostanza dalla colonna. Se V X = 0 le sostanze non vengono trattenute dalla fase stazionaria, quindi K c =0. V X è correlata al volume di fase stazionaria V S indipendentemente da K C V R =V M +K C x Vs equazione fondamentale della cromatografia. 2
3 4 A TCB 3 FATTORI DI RITENZIONE E CAPACITÀ: K= ns/nm ns= numero di moli della fase stazionaria nm= numero di moli nella fase mobile. K = (Cs x Vs ) / (Cm x Vm) ns= Cs x Vs nm=cm x Vr Kc= Cs/Cm K= (Vs/Vm)xKc K è il parametro che caratterizza il comportamento di una determinata coppia di fasi e di un determinato tipo di colonna nei confronti di una determinata sostanza. K= T 1 R/ T M SELETTIVITÀ: è la capacità di un sistema cromatografico di eliminare specie chimiche diverse a velocità il più possibile diverse in modo che siano l una separata dall altra. =T 1 R2/T 1 R1 = K 2 /K 1 = Kc 2 /Kc 1 3
4 4 A TCB 4 EFFICIENZA: è la capacità di un sistema di eliminare tutte le particelle di una stessa sostanza con la stessa velocità in modo da vere picchi stretti. Se consideriamo che il picco abbia una forma ideale di una gaussiana per la larghezza del picco si può considerare il rapporto fra le deviazioni standard Ed il tempo di ritenzione T R sarà uguale alla deviazione standard relativa. R = /T R questi valori sono molto piccoli quindi si considera il quadrato del reciproco, ed è indicato con N. 2 N= al numero di piatti teorici. N= (T R / R ) N: è definito come quel tratto della colonna in cui una data specie chimica si trova in equilibrio fra le due fasi, (mobile e stazionaria), prima che l eluente la trascini verso il piatto successivo. N si può esprimere facendo riferimento alla larghezza del picco alla base Wb= 4 N= 16(T R /Wb) 2 Oppure in funzione della larghezza a metà altezza Wh che è più facile da misurare. N=5,545((T R /Wh) 2 N eff numero di piatti effettivi N eff = 16 (T 1 R/Wb) 2 4
5 4 A TCB 5 ALTEZZA DEL PIATTO TEORICO: si indica con H ed è il rapporto tra L/N=H L= lunghezza della colonna N= numero di piatti teorici. Una colonna è tanto più efficiente e fornisce picchi tanto più stretti, quanto minore è il valore di H. H non dipende da L. H eff = L/N eff TEORIA DELLA VELOCITA : serve per spiegare l efficienza di un sistema da un punto di vista dinamico. H= f(û) û= alla velocità lineare media (cm/s o mm/s) Questa funzione ci dice che esiste un valore di û in cui il valore dell altezza del piatto teorico H è minimo. EQUAZIONE DI VAN DEEMTER: H altezza equivalente del piatto teorico in funzione della velocità o del flusso della fase mobile. 5
6 4 A TCB 6 Se confrontiamo i due grafici a e b si evidenzia che: 1. le scale di H hanno valori differenti in HPLC e SFC molto più piccoli della GC. 2. le curve sono molto simili (iperboli e parabole). La equazione H= f(û) si può scrivere come y=a+b/x+cx È il risultato di una combinazione lineare di 3 equazioni Y=a retta parallela all asse x Y=b/x iperbole equilatera Y=cx retta passante per l origine con coefficiente angolare c. Ognuna delle tre equazioni esprime il contributo di fenomeni chimico fisici. H=A+B/ û +C û û=velocità media della fase mobile A: nella colonna impaccata è associato in percorsi multipli o alla diffusione microvorticosa. B: diffusione molecolare longitudinale. C: resistenza del trasferimento di massa. L equazione di VAN DEEMTER descrive l altezza equivalente al piatto teorico H in funzione della velocità lineare media della fase mobile. Indica quel valore teorico ottimale della velocità del flusso della fase mobile in cui H è minimo. Ricordando che più è piccolo H più piatti teorici ci sono nella colonna ne consegue che vi sono più equilibri fra fasi ed è quindi più efficiente. 6
7 4 A TCB 7 ASIMMETRIA DEI PICCHI.: Fronting Tailing: la forma di questo picco è conseguenza di un segnale che sale rapidamente e scende lentamente. Fronting: la forma di questo picco è conseguenza di unsegnale che sale lentamente e scende rapidamente. La formazione dei picchi asimmetrici dipende: 1. introduzione troppo lenta della miscela 2. adsorbimento irreversibile della sostanza sulla fase stazionaria 3. reazioni chimiche in colonna 4. sovraccarico, saturazione dei siti attivi. 5. variazione del Kc. 7
8 4 A TCB 8 FORMULARIO Tempo di ritenzione corretto T 1 R= T R -T M Volume di ritenzione corretto V 1 R=V R - V R Fattore di separazione =T 1 R2/T 1 R1 Numero di piatti teorici N= 16(T R /Wb) 2 Numero di piatti teorici a metà altezza N=5,545((T R /Wh) 2 Fattore di ritenzione K=nS/nM Altezza equivalente del piatto teorico H H=L/N oppure H= 2 /N Risoluzione Rs= (T R2 -T R1 )/[(W B1 +W B2 )/2] risoluzione: ESERCIZI 1. una colonna impaccata fornisce, per un dato picco un tempo di ritenzione di 4,5 min, 1800 piatti teorici. Calcolare la larghezza del picco. 2. calcolare la risoluzione tra due picchi i cui tempi di ritenzione sono rispettivamente di 4,82 min e 5,43 min, mentre le larghezze alla base sono 0,37 e 0,35 min. 3. calcolare il numero di piatti richiesti per ottenere una risoluzione di 1,2 fra due picchi caratterizzati da un fattore di separazione 1,08 sapendo che il secondo picco k=5,1 stabilire se si debba usare una colonna capillare o impaccata. 4. una miscela composta da dietiletere, etanolo e n-propanolo (1:1,5:1,8), separata con carbowax 20M (colonna 2 m x 2 mm ID, rivelatore FID), fornisce tre picchi, la cui area è, rispettivamente, di 360, 435, 562 mm 2. calcolare i fattori di risposta rispesto al dietiletere. 5. calcolare il fattore di ritenzione di ogni composto del problema precedente sapendo che i rispettivi tempi di ritenzione sono di 41, 73 e 101 s. mentre il picco del metano (praticamente non trattenuto)è uscito dopo 5 s. risoluzione: 6. calcolare l efficienza in termini di H della colonna nei confronti dei composti del problema precedente sapendo che le rispettive basi a metà altezza sono di 2,5 4,5 e 6 secondi. 7. una separazione in GLC degli esteri metilici di alcuni acidi grassi su LAC 728 (colonna di 2 m) ha dato i seguenti risultati: 8
9 4 A TCB 9 T R min Area Altezza C 12 3, C 14 5, C 16 10, Calcolare N e H per i tre composti usando i valori delle ipotetiche basi a metà altezza calcolati in base ai dati dell esperimento, supponendo di assimilare i picchi a triangolo. 9
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