TECNICHE CROMATOGRAFICHE

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1 TECNICHE CROMATOGRAFICHE

2 Le tecniche cromatografiche permettono di separare gli analiti presenti in una miscela complessa.

3 Tutti i sistemi cromatografici sono costituiti da una fase stazionaria, che puo essere un solido, un gel, un liquido o una miscela solido/liquido ed e immobilizzata, ed una fase mobile, che puo essere liquida o gassosa e fluisce sopra od attraverso la fase stazionaria.

4 IL CROMATOGRAMMA Rappresentazione illustrata della risposta del rilevatore in funzione del tempo o del volume di eluizione. Consiste in una serie di picchi, che rappresentano l eluizione dei singoli analiti.

5 IL CROMATOGRAMMA

6 Tempo di ritenzione (t R ) Tempo impiegato da ciascun analita per uscire dalla colonna. Il t R ha due componenti: il tempo morto (t M ), cioe il tempo necessario per passare attraverso gli spazi liberi nella matrice della fase stazionaria, ed il t R, cioe il tempo in cui l analita e trattenuto dalla fase stazionaria. Quindi, il tempo di ritenzione adattato e : t R = t R -t M

7 Volume di eluizione o di ritenzione (V r ) Volume richiesto per eluire l analita

8 Fattore di capacita (k ) Indica il tempo relativo che occorre all analita per eluire dalla colonna, in relazione ad un analita non trattenuto (o escluso), che non interagisce con la fase stazionaria e che, per definizione, ha un k pari a 0. Per cui si ha: k = (t R t M )/ t M = t R / t M

9 Il fattore di capacita (k ) e correlato al coefficiente di distribuzione (K d ) dell analita. Poiche la quantita e la concentrazione sono in relazione con il volume, si puo scrivere: k = K d x V S /V M dove V S e il volume della fase stazionaria V M e il volume vuoto o spazio morto

10 Fattore di separazione (α) E una misura della capacita intrinseca del sistema di discirminare tra due analiti. Tale fattore puo essere espresso come : α = k A /k B = t R A /t' RB

11 Efficienza della colonna e risoluzione Si ritiene che le colonne cromatografiche consistano in un numero (N) di zone adiacenti, in ciascuna delle quali c e lo spazio sufficiente per equilibrare completamente l analita tra le due fasi. Ogni zona e detta piatto teorico. La lunghezza della colonnna contenente un piatto teorico e detta altezza del piatto (H), generalmente misurata in micrometri.

12 Il numero dei piatti teorici e : N=L/H [1] dove L e la lunghezza della colonna Vale anche la relazione: N = 5.54[(t R t M )/w 1/2 ] 2

13 Se si considera la posizione di un picco, la [1] puo essere espressa come: N=16L 2 /w 2 [2] dove w e la larghezza della base del picco in oggetto Inoltre, si definisce l altezza equivalente del piatto teorico (HETP) come HETP = L/N

14 La risoluzione e definita come il rapporto della differenza nel tempo di ritenzione tra i due picchi ed il valore medio delle loro larghezze di base (w av ): R S = 2(t RA t RB )/(w A w B ) = t R / w av [3]

15 La risoluzione e influenzata da: - efficienza del sistema - fattore di selettivita - fattore di capacita di conseguenza, la [3] puo essere scritta come: R S = (N -2 /4) x (α-1/α) x (k 2 /1-k av ) [4] dove k 2 è il fattore di capacita per il picco trattenuto piu a lungo k av è il fattore di capacita medio per i due analiti

16 Equazione di van Deemter per la risoluzione R s = ½ x (a-1/a+1) x k 2 /1+k 2 x (L/h) 1/2 [5] Dove: a fattore di selettività (separazione) a = t R1 /t R2 k termine di migrazione, fattore di capacità; L lunghezza della colonna h altezza piatto

17 LA MATRICE La matrice e il materiale che viene utilizzato per fornire un supporto alla fase stazionaria CARATTERISTICHE - Elevata stabilita meccanica - Presenza di gruppi funzionali - Elevata capacita - Pori di dimensioni e forma controllata - Superficie inerte per ridurre l assorbimento non selettivo degli analiti

18 TIPI DI MATRICE AGAROSIO CELLULOSA DESTRANO POLIACRILAMMIDE POLISTIRENE SILICE

19 SISTEMI CROMATOGRAFICI

20 SCELTA DI UN SISTEMA CROMATOGRAFICO

21 CROMATOGRAFIA SU COLONNA La fase stazionaria e attaccata ad una matrice adatta ed impaccata all interno di una colonna di vetro o metallo. La fase mobile viene fatta passare nella colonna per gravita.

22 La cromatografia liquida su colonna si divide in: - Cromatografia liquida a bassa pressione (LPLC, low pressure liquid chromatography) - Cromatografia liquida a media pressione (MPLC, medium pressure liquid chromatography) - Cromatografia liquida ad alta pressione [o meglio prestazione] (HPLC, high pressure [performance] liquid chromatography)

23 Schema di un sistema per HPLC

24 APPLICAZIONI Separazione di ormoni, droghe, farmaci, amminoacidi, zuccheri, oligopeptidi e proteine.

25 CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO Questo processo coinvolge forze di interazione deboli, come le forze di Van der Waals ed i legami idrogeno. Il fenomeno si verifica solo in corrispondenza di specifici siti di adsorbimento.

26 Tipologie di cromatografia di adsorbimento - Cromatografia su idrossiapatite - Cromatografia per interazione idrofobica

27 I solventi vengono scelti in base alle caratteristiche degli analiti - Alcoli, se gli analiti contengono gruppi idrossilici - Acetone o Esteri, se gli analiti presentano gruppi carbonilici - Idrocarburi, per analiti non polari.

28 CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE Questa tecnica dipende dai coefficienti di distribuzione (Kd) ed utilizza fasi stazionarie e fasi mobili liquide.

29 Tipologie di cromatografia di partizione - Cromatografia liquida in fase normale - Cromatografia liquida in fase inversa - Cromatografia liquida in fase inversa per accoppiamento ionico - Cromatografia chirale - Cromatografia controcorrente

30 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Si basa sull attrazione tra particelle di carica opposta. Le separazioni a scambio ionico vengono effettuate su colonne impaccate con uno scambiatore ionico.

31 SCAMBIATORI IONICI (1) - Scambiatori anionici o basici: molecole con gruppi carichi positivamente che legano molecole anioniche (cariche negativamente) - Scambiatori cationici o acidi: molecole con gruppi carichi negativamente che legano molecole cationiche (cariche positivamente)

32 SCAMBIATORI IONICI (2) - Scambiatori forti: sono completamente ionizzati a tutti i valori di ph; sono i gruppi solfonato e le ammine quaternarie - Scambiatori deboli: sono ionizzati solo in un ristretto intervallo di ph; sono i gruppi carbossilici e dietilammonio

33 Il meccanismo di scambio ionico si basa su cinque passaggi: 1. Diffusione dello ione sulla superficie di scambio 2. Diffusione dello ione attraverso la matrice fino al sito di scambio 3. Scambio di ioni al sito d interazione 4. Diffusione dello ione scambiato fino alla superficie 5. Distacco selettivo dello ione scambiato ad opera dell eluente e diffusione della molecola nell eluente esterno.

34 Schema di una cromatografia a scambio ionico Nella resina scambiatrice di cationi(o anioni) il catione (o anione) presente nella msicela viene legato al posto degli ioni del tampone con cui era stata equilibrata la colonna.

35 CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE (o gel filtrazione) La separazione delle molecole, sulla base della loro dimensione molecolare e della forma, utilizza le proprieta del setaccio molecolare di una varieta di materiali porosi.

36 V t = V 0 + V i [5] dove V i e la somma del volume interno dei granuli di resina V 0 e il volume morto V t e il volume totale occupato dalla resina rigonfiata dal solvente

37 La distribuzione dell analita nella colonna dipende dal volume totale di fase mobile disponibile. Per un dato gel, il fattore di distribuzione Kd di un particolare analita dipende dalle sue dimensioni molecolari. K d = V e -V 0 /V t -V 0 [6] K d = 0 molecola grande K d = 1 molecola piccola

38 APPLICAZIONI Purificazione delle macromolecole biologiche Determinazione della massa molecolare relativa Dissalazione Studi proteina-ligando Concentrazione delle soluzioni

39 CROMATOGRAFIA DI AFFINITA Questa tecnica si avvale dell estrema specificita delle interazioni di riconoscimento molecolare, per ottenere la separazione e la purificazione delle molecole.

40 Tipologie di cromatografia di affinita - Cromatografia di affinita con lectine - Cromatografia di immunoaffinita - Cromatografia con chelanti di metalli - Cromatografia con ligandi colorati - Cromatografia covalente

41 Schema di purificazione di un enzima

42 CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONALE Tecnica che permette di migliorare la risoluzione delle separazioni per partizione ed adsorbimento.

43 Il materiale che deve essere separato viene posizionato sotto forma di macchia in un angolo della lastrina, che viene sviluppata e, quindi, rimossa dal contenitore e fatta seccare. In seguito viene sviluppata con un secondo sistema di solventi, per i quali i composti da separare hanno diversi valori di Kd.

44 CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO (GLC o GC) Si basa sulla ripartizione tra una fase liquida ed una gassosa. Le colonne utilizzate sono capillari di vetro o metallo con diametro interno tra 0.03 e 0.1 mm e lunghe fino a 100 metri.

45 Schema dell apparato per GC

46 Fase Stazionaria E un liquido ad alto punto di ebollizione Puo essere : - fase stazionaria selettiva, che sfrutta le caratteristiche chimiche dei componenti - fase stazionaria non selettiva, che sfrutta i diversi punti di ebollizione Fase Mobile E costituita da un gas inerte come azoto, elio oppure argon

47 Sistemi di rilevazione - Rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID) - Rivelatore a cattura di elettroni (ECD)

48 CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE La fase stazionaria, legata ad una matrice adatta, si trova stratificata su una superficie di vetro, plastica o metallo. La fase mobile liquida passa per capillarita sul sottile strato di materiale, in posizione orizzontale o verticale.

49 Il movimento dell analita e caratterizzato dal suo fattore di ritardo, R f. R f = distanza percorsa dall analita distanza percorsa dal solvente

50 Sistemi di rilevazione - Esame della lastrina sotto luce ultravioletta, per composti che assorbono nella zona dell ultravioletto o fluorescenti - Esame della lastrina sootoposta ad autoradiografia - Esame della lastrina mediante l uso di agenti specifici.